ATSAUCĒ IETVERT:
Zemkopības ministrijas 2005. gada 22. marta instrukcija Nr. 9 "Dzīvnieku barības paraugu analīžu metodika". Publicēts oficiālajā laikrakstā "Latvijas Vēstnesis", 31.03.2005., Nr. 51 https://www.vestnesis.lv/ta/id/104667
RĪKI
Oficiālā publikācija pieejama laikraksta "Latvijas Vēstnesis" drukas versijā.
Zemkopības ministrijas instrukcija Nr.9
Rīgā 2005.gada 22.martā
Dzīvnieku barības paraugu analīžu metodika
Izdota saskaņā ar Dzīvnieku barības aprites likuma 30. panta pirmo daļu
1. Instrukcija nosaka dzīvnieku barības (turpmāk – barība) paraugu analīžu metodiku.
2. Mitrumu barības paraugam nosaka pirms tā sagatavošanas analīzēm un pēc tam.
3. Barības paraugu sadala divās daļās. Paraugu rūpīgi sajauc uz tīras, sausas virsmas un sadala ar mehānisku ierīci vai ar rokām. Vienu daļu parauga pēc sadalīšanas atstāj neizmainītā veidā un nekavējoties ievieto sausā konteinerā ar cieši piegulošu vāku, bet otru (vismaz 100g) sagatavo ķīmiskajām analīzēm.
4. Barības paraugu analīzēm sagatavo tā, lai gatavā parauga apjoms ir viendabīgs, pilnībā atbilst kopējam paraugam un bez piesārņojuma.
5. Barības paraugus nedrīkst malt iekārtās, kuras malšanas procesā sasilst. Tādā gadījumā tie jāmaļ ar rokām.
6. Ļoti mitru paraugu žāvē piemērotā temperatūrā, līdz tā mitrums ir 8 – 12%.
7. Ķīmiskajām analīzēm paraugu sagatavo:
7.1. barību, kas sasmalcināma bez žāvēšanas, sasmalcina un izsijā caur 1mm sietu (saskaņā ar ISO 565 standarta prasībām). Izsijāto paraugu samaisa un ievieto piemērotā, tīrā un sausā konteinerā ar gaisu necaurlaidīgu vāku. Paraugu pirms svēršanas samaisa;
7.2. barībai, kas sasmalcināma pēc žāvēšanas, nosaka mitruma procentu un izžāvē tā, lai mitrums ir 8 – 12%. Pēc tam rīkojas, kā aprakstīts 8.1. apakšpunktā;
7.3. šķidrai vai vidēji šķidrai barībai paraugu ievieto piemērotā, tīrā, sausā konteinerā ar gaisu necaurlaidīgu vāku. Pirms iesvara nosvēršanas paraugu kārtīgi samaisa;
7.4. barības paraugu, kuru nevar sagatavot saskaņā ar kādu no 7.1., 7.2. vai 7.3. apakšpunktā aprakstītajām metodēm, sagatavo ar citas metodes palīdzību, kas nodrošina parauga viendabīgumu un raksturo kopējo paraugu.
8. Barības paraugus uzglabā temperatūrā, kas neietekmē to sastāvu. Paraugus, kuros paredzēts noteikt vitamīnus vai pret gaismu jutīgas vielas, uzglabā brūnos stikla konteineros.
9. Reaģenti, kurus izmanto analīžu veikšanai, atbilst tīrības pakāpei “ analītiski tīrs” (a.t.), ja analīžu veikšanas metodikā nav noteikts citādi. Nosakot mikroelementus, reaģenta tīrību pārbauda ar “tukšo” analīzi. Ja nepieciešams, veic reaģenta attīrīšanu.
10. Ja nepieciešams šķīdināt, atšķaidīt, skalot vai mazgāt, bet nav norādīts šķīdinātājs vai atšķaidītājs, tādā gadījumā izmanto ūdeni. Ūdens ir demineralizēts. Atbilstoši analīžu metodikai atsevišķos gadījumos nepieciešams veikt speciālu ūdens attīrīšanu.
11. Analīžu metodikās norāda tikai specifiskās iekārtas, kuras ir nepieciešamas analīzes veikšanai. Izmanto tīras laboratorijas iekārtas. Tas ir ļoti būtiski tajos gadījumos, kad veic mērījumus paraugiem ar ļoti zemu nosakāmās vielas koncentrāciju.
12. Katras barības ķīmiskās sastāvdaļas noteikšanai ir izstrādāta viena vai vairākas metodes. Laboratorija testēšanas pārskatā norāda izmantoto metodi.
13. Testēšanas pārskatā norāda vidējo rezultātu, kuru aprēķina no vismaz divu mērījumu rezultātiem, kas iegūti no dažādiem parauga iesvariem un kuriem ir pieņemama atkārtojamība. Rezultātu pārskatā norāda ar tik daudz cipariem, kā noteikts analīzes metodikā un, ja nepieciešams, to koriģē, ņemot vērā izmeklējamā parauga sākotnējo mitruma procentu. Ja nav speciālas norādes, tad rezultātu izsaka procentos no sākotnējā parauga masas.
14. Dzīvnieku barības paraugus izmeklē saskaņā ar šīs instrukcijas 1. līdz 48. pielikumu.
15. Ar šīs instrukcijas spēkā stāšanos spēku zaudē Zemkopības ministrijas 2004.gada 2.jūnija instrukcija Nr.13.
Informatīvā atsauce uz Eiropas Savienības direktīvām
Instrukcijā iekļautas tiesību normas, kas izriet no:
Komisijas 1971. gada 15. jūnija pirmās Direktīvas 71/250/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei;
Komisijas 1971. gada 18. novembra otrās Direktīvas 71/393/EEK, kas nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei;
Komisijas 1972. gada 27. aprīļa trešās Direktīvas 72/199/EEK, kas nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei;
Komisijas 1972. gada 5. decembra ceturtās Direktīvas 73/46/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei;
Komisijas 1976. gada 1. marta septītās Direktīvas 76/372/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei;
Komisijas 1978. gada 15. jūnija astotās Direktīvas 78/633/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei,
Komisijas 1981. gada 31. jūlija devītās Direktīvas 81/715/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei;
Komisijas 1984. gada 25. jūlija desmitās Direktīvas 84/425/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei;
vienpadsmitās Komisijas 1993. gada 28. jūlija Direktīvas 93/70/EEK, ar ko Kopienā ievieš analīzes metodes oficiālai lopbarības kontrolei;
divpadsmitās Komisijas 1993. gada 17. decembra Direktīvas 93/117/EK, ar ko ievieš Kopienas analīzes metodes oficiālai barības kontrolei;
Komisijas 1999. gada 20. aprīļa Direktīvas 1999/27/EK par Kopienas metožu ieviešanu amprolija, diklazurila un karbadoksa noteikšanai barībā, ar ko groza Direktīvu 71/250/EEK, 73/46/EEK, un atceļ direktīvu 74/203/EEK;
Komisijas 1999. gada 23. jūlija Direktīvas 1999/76/EK par Kopienas analīzes metodes ieviešanu nātrija lasalocīda noteikšanai lopbarībā;
Komisijas 1999.gada 27.jūlija Direktīvas 1999/79/EK, ar kuru groza Komisijas 1972.gada 27.aprīļa trešo Direktīvu 72/199/EEK, kas nosaka Kopienas analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei;
Komisijas 2000. gada 6. jūlija Direktīvas 2000/45/EK, kas nosaka Kopienas analīžu metodes A vitamīna, E vitamīna un triptofāna noteikšanai barībā;
Komisijas 2002. gada 26. jūlija Direktīvas 2002/70/EK, ar ko nosaka prasības dioksīnu un dioksīniem līdzīgu PCB koncentrācijas noteikšanai barībā;
Komisijas 2003.gada 23.decembra Direktīvas 2003/126/EK par dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu noteikšanas analīzes metodi oficiālai lopbarības kontrolei.
Saskaņots ar Tieslietu ministriju 2005.gada 16.martā
Zemkopības ministrs M.Roze
1.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Zilskābes noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka brīvo zilskābi un glikozīdu sastāvā saistīto zilskābi barībā, jo īpaši produktos, ko iegūst no linsēklām, maniokas miltiem un dažām pākšaugu sugām.
2. Princips
Paraugu suspendē ūdenī. Zilskābi izdala fermentatīvā reakcijā, atdestilē ar tvaiku un uztver noteiktā tilpumā paskābināta sudraba nitrāta šķīduma. Sudraba cianīdu atdala filtrējot, un sudraba nitrāta pārākumu titrē ar amonija tiocianāta šķīdumu.
3. Reaģenti
3.1. Saldo mandeļu suspensija: divdesmit izlobītas saldās mandeles 37 līdz 40°C temperatūrā saberž 100 ml ūdens. Ņem 10 ml suspensijas un pārbauda, vai tajā nav zilskābes, izmantojot nātrija pikrāta papīru vai veicot tukšā parauga analīzi saskaņā ar 5. punkta pēdējā daļā doto aprakstu.
3.2. nātrija acetāta 10 % (m/V) šķīdums, pārbaudot ar fenolftaleīnu, neitrāls
3.3. Pret putu emulsija (piemēram, silikona emulsija)
3.4. Slāpekļskābe – d: 1,40
3.5. 0,02n sudraba nitrāta šķīdums
3.6. 0,02n amonija tiocianāta šķīdums
3.7. Amonija dzelzs sulfāta piesātināts šķīdums
3.8. Amonjaka šķīdums – d: 0,958
4. Aparatūra
4.1. Žāvēšanas skapis ar termostatu, kas ieregulēts 38°C temperatūrā
4.2. Aparāts destilēšanai ar ūdens tvaiku, kas aprīkots ar dzesinātāju un liektu alonžu
4.3. 1000 ml tilpuma stāvkolbas ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem
4.4. Eļļas vanna
4.5. Birete ar 1/20 ml tilpuma iedaļām
5. Darba gaita
5.1. Ņem 20g parauga iesvara ar precizitāti līdz 5mg un pārnes uz 1 litra tilpuma stāvkolbu, pievieno 50 ml ūdens un 10 ml saldo mandeļu suspensijas (3.1.). Kolbu noslēdz ar aizbāzni un uz sešpadsmit stundām ievieto žāvēšanas skapī 38°C temperatūrā. Tālāk atdzesē līdz istabas temperatūrai, pievieno 80 ml ūdens, 10 ml nātrija acetāta šķīduma (3.2.) un pilienu pretputu emulsijas (3.3.).
5.2. Kolbu pievieno destilēšanas aparātam ar ūdens tvaiku un ievieto eļļas vannā, ko iepriekš uzkarsē līdz temperatūrai, kas nedaudz pārsniedz 100°C. Ar spēcīgu ūdens tvaika plūsmu, ko laiž cauri kolbai, kuru uzmanīgi silda eļļas vannā, atdestilē 200 līdz 300 ml šķidruma. Destilātu uztver Erlenmeijera kolbā, kas aizsargāta no gaismas iedarbības un kurā ir precīzi 50 ml 0,02 n sudraba nitrāta šķīduma (3.5.) un 1 ml slāpekļskābes (3.4.). Pārbauda, vai dzesinātāja alonža gals ir iemērkts sudraba nitrāta šķīdumā.
5.3. Erlenmeijera kolbas saturu pārnes 500 ml tilpuma mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar ūdeni, samaisa un filtrē. Ņem 250 ml filtrāta, kam pievieno apmēram 1 ml amonija dzelzs sulfāta šķīduma (3.7.), un, lietojot bireti ar 1/20 ml tilpuma iedaļām, sudraba nitrāta pārākumu attitrē ar 0,02n amonija tiocianāta šķīdumu (3.6.).
5.4. Ja vajadzīgs, piemērojot šo pašu procedūru, veic tukšā parauga analīzi, tai ņemot tikai 10 ml saldo mandeļu suspensijas (3.1.).
6. Rezultātu aprēķināšana
Ja tukšā parauga titrēšanai patērēts 0,02n sudraba nitrāta šķīdums, tā tilpumu atņem no parauga destilāta titrēšanai patērētā šķīduma tilpuma. 1 ml 0,02n AgNO3 atbilst 0,54mg HCN. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
7. Piezīmes
7.1. Ja paraugā lielā daudzumā ir sulfīdi (piemēram, pupās), veidojas melnas sudraba sulfīda nogulsnes, kuras nofiltrē kopā ar sudraba cianīda nogulsnēm. Šo nogulšņu veidošanās dēļ rodas 0,02n sudraba nitrāta šķīduma zudumi, un šis tilpums ir jāatņem no HCN satura aprēķināšanai izmantojamā tilpuma. To izdara šādi.
7.2. Sudraba cianīdu izšķīdina, nogulsnes uz filtra apstrādājot ar 50 ml amonjakūdens (3.8.). Atlikumu mazgā ar atšķaidītu amonjakūdeni un tad nosaka tā sudraba saturu. Iegūto lielumu pārvērš ml 0,02n sudraba nitrāta šķīduma.
7.3. Parauga HCN saturu var noteikt arī, amonjakālo filtrātu pēc paskābināšanas titrējot ar slāpekļskābi.
Zemkopības ministrs M.Roze
2.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Kalcija noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka kopējo kalcija saturu barībā.
2. Princips
Paraugu pārpelno, pelnus izšķīdina sālsskābē un kalciju izgulsnē kalcija oksalāta veidā. Nogulsnes izšķīdina sērskābē un radušos skābeņskābi titrē ar kālija permanganāta šķīdumu.
3. Reagenti
3.1. Sālsskābe – analītiski tīra (a.t.), d: 1,14;
3.2. Slāpekļskābe – a.t., d: 1,40;
3.3. Sērskābe – a.t., d: 1,13;
3.4. Amonija hidroksīds – a.t., d: 0,98;
3.5. Aukstumā piesātināts amonija oksalāta šķīdums – a.t.;
3.6. Citronskābes šķīdums – a.t., 30 % (m/V);
3.7. Amonija hlorīda šķīdums – a.t., 5 % (m/V);
3.8. Bromkrezola zaļā 0,04 % (m/V) šķīdums;
3.9. Kālija permanganāta 0,1n šķīdums.
4. Aparatūra
4.1. ventilējama elektriskā mufeļkrāsns ar termostatu;
4.2. Platīna, kvarca vai porcelāna tīģeļi pārpelnošanai;
4.3. Stikla filtrtīģeļi ar G4 porainību.
5. Darba gaita
5.1. Ņem apmēram 5g parauga iesvara (vai lielāku, ja vajadzīgs) ar precizitāti līdz mg, pārpelno 550 °C temperatūrā un pelnus pārnes uz 250 ml tilpuma vārglāzi.
5.2. Pievieno 40 ml sālsskābes (3.1.), 60 ml ūdens un dažus pilienus slāpekļskābes (3.2.). Uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai un vāra 30 minūtes. Šķīdumu atdzesē un pārnes uz 250 ml tilpuma mērkolbu. Noskalo, ar ūdeni uzpilda līdz atzīmei, homogenizē un filtrē.
5.3. Ar pipeti 250 ml tilpuma vārglāzē pārnes šķīduma alikvoto daļu, kurā atkarībā no gaidāmā kalcija satura ir 10 līdz 40 mg kalcija. Pievieno 1 ml citronskābes šķīduma (3.6.) un 5 ml amonija hlorīda šķīduma (3.7.). Šķīdumu papildina ar ūdeni līdz apmēram 100 ml tilpumam. Uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai, pievieno astoņus līdz desmit pilienus bromkrezola zaļā šķīduma (3.8.) un 30 ml silta amonija oksalāta šķīduma (3.5.). Ja veidojas nogulsnes, tās izšķīdina, pievienojot dažus pilienus sālsskābes (3.1.).
5.4. Ļoti lēnām, pastāvīgi maisot, neitralizē ar amonija hidroksīdu (3.4.) līdz pH 4,4 – 4,6 (tas ir, līdz indikatora krāsas maiņai). Vārglāzi uz 30 minūtēm ievieto verdoša ūdens vannā, līdz nogulsnējas radušās nogulsnes. Vārglāzi izņem no ūdens vannas. Stundu nostādina un filtrē caur G4 filtrtīģeli.
5.5. Vārglāzi un filtrtīģeli mazgā ar ūdeni, līdz pilnībā atdalīts amonija oksalāta pārākums (ja mazgāšanas ūdenī nav hlorīdu, tas liecina, ka mazgāts pietiekami).
5.6. Uz filtra esošās nogulsnes izšķīdina ar 50 ml silta sērskābes šķīduma (3.3.). Filtrtīģeli izskalo ar siltu ūdeni un filtrāta tilpumu papildina līdz apmēram 100 ml. Uzsilda līdz 70 – 80°C un pa pilienam titrē ar kālija permanganāta šķīdumu (3.9.), līdz parādās sārts krāsojums, kas saglabājas vienu minūti.
6. Rezultātu aprēķināšana
1 ml 0,1n kālija permanganāta šķīduma atbilst 2,004mg kalcija. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
7. Piezīmes
7.1. Ja kalcija saturs ir ļoti zems, rīkojas šādi: kalcija oksalāta nogulsnes filtrē caur bezpelnu filtrpapīru. Pēc mazgāšanas filtru izžāvē un pārpelno platīna tīģelī 550°C temperatūrā. Atlikumu izšķīdina dažos pilienos sērskābes (3.3.), iztvaicē sausu, atkārtoti pārpelno 550°C temperatūrā un nosver. Ja W ir iegūtā kalcija sulfāta masa, kalcija saturs alikvotajā daudzumā ir = W × 0,2944, kur: X– kalcija saturs un m – iegūtā kalcija sulfāta masa
7.2. Ja parauga sastāvā ir tikai minerālvielas, to izšķīdina sālsskābē, iepriekš nepārpelnojot. Analizējot skābē grūti šķīdināmus produktus, piemēram, kalcija alumīnija fosfātu, tos pirms šķīdināšanas sakausē ar sārmu: analizējamo paraugu platīna tīģelī rūpīgi sajauc ar pieckārtīgu maisījuma pārākumu, kurā līdzīgās daļās ir kālija karbonāts un nātrija karbonāts. Uzmanīgi karsē, līdz maisījums pilnīgi izkūst. Atdzesē un izšķīdina sālsskābē
7.3. Ja paraugos ir augsts magnija saturs, kalcija oksalātu izgulsnē otrreiz.
Zemkopības ministrs M.Roze
3.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Karbonātu noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
1.1. Ar šo metodi nosaka karbonātu daudzumu lielākajā daļā barības veidu. Rezultātu parasti izsaka kā kalcija karbonātu.
1.2. Tomēr dažos gadījumos (piemēram, dzelzs karbonāta noteikšanai) izmanto speciālu metodi.
2. Princips
Karbonātus sadala ar sālsskābi, izdalījušos oglekļa dioksīdu uztver gāzu biretē un tā tilpumu salīdzina ar oglekļa dioksīda tilpumu, kas izdalās tādos pašos apstākļos, sadaloties zināmam daudzumam analītiski tīra kalcija karbonāta.
3. Reaģenti
3.1. Sālsskābe – d: 1,10;
3.2. Kalcija karbonāts – a.k.;
3.3. Sērskābes aptuveni 0,1n šķīdums, kas iekrāsots ar metilsarkano.
4. Aparatūra
Šaiblera–Dītriha aparāts vai tam līdzvērtīga iekārta
5. Procedūra
5.1. Analīzei ņemtā iesvara lielums ir atkarīgs no karbonātu satura paraugā:
5.1.1. 0,5g produktiem, kas satur 50 līdz 100% karbonātus, pārrēķinot kalcija karbonātā;
5.1.2. 1g produktiem, kas satur 40 līdz 50% karbonātus, pārrēķinot kalcija karbonātā;
5.1.3. 2 līdz 3g pārējiem produktiem.
5.2. Paraugu pārnes uz aparāta speciālo kolbu, kas aprīkota ar nelielu neplīstoša materiāla mēģeni, kurā ir 10 ml sālsskābes (3.1.), un kolbu pievieno aparātam. Pagriež trīsceļu krānu tā, lai gāzu birete būtu savienota ar atmosfēru. Izmantojot pārvietojamu cauruli, kas piepildīta ar iekrāsotu sērskābes šķīdumu (3.3.) un pievienota gāzu biretei, šķidruma līmeni iestāda līdz nulles atzīmei. Pagriež krānu, savienojot gāzu bireti ar cauruli, un pārbauda, vai līmenis ir pret nulles atzīmi.
5.3. Kolbu pagāžot uz sāna, paraugam lēni pārlej sālsskābi (3.1.). Nolaižot zemāk cauruli, izlīdzina spiedienu. Kolbu krata, līdz pilnīgi izbeidzas oglekļa dioksīda izdalīšanās. Atjauno spiedienu, izlīdzinot šķidruma līmeni biretē un caurulē. Pēc dažām minūtēm, kad gāzes tilpums kļuvis nemainīgs, izdara nolasījumu.
5.4. Tādos pašos apstākļos analizē 0,5g kalcija karbonāta (3.2.) kontrolparaugu.
6. Rezultātu aprēķināšana
Kalcija karbonātā pārrēķinātu parauga karbonātu saturu gramos aprēķina pēc šādas formulas:
V x 100
–––––––,
T x 2W
kur
V = no parauga iesvara izdalītais CO2 tilpums ml
T = no 0,5 g a.t. CaCO3 izdalītais CO2 tilpums ml
W = analizējamā parauga iesvara masa g
7. Piezīmes
7.1. Ja parauga iesvars ir lielāks par 2 g, kolbā (4) vispirms iepilda 15 ml ūdens un pirms analīzes samaisa. Kontrolparauga analīzei ņem tādu pašu ūdens daudzumu
7.2. Ja izmantotajam aparātam ir no Šaiblera–Dītriha aparāta atšķirīgs tilpums, attiecīgi jāmaina parauga un kontrolei izmantotās vielas iesvars, kā arī jākoriģē rezultātu aprēķini.
Zemkopības ministrs M.Roze
4.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Koppelnu noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka koppelnu saturu barībā.
2. Princips
Paraugu pārpelno 550°C temperatūrā, atlikumu nosver.
3. Reaģenti
Amonija nitrāta 20 % (m/V) šķīdums
4. Aparatūra
4.1. Elektriskā plītiņa;
4.2. Termostatējama elektriskā mufeļkrāsns;
4.3. Taisnstūraini (60 × 40 × 25 mm) vai apaļi (60 līdz 70 mm diametrā, augstums no 20 līdz 25 mm) tīģeļi no platīna vai platīna un zelta sakausējuma (10 % Pt, 90 % Au) pārpelnošanai.
5. Darba gaita
Ņem apmēram 5g lielu parauga iesvaru (2,5g – produktiem, kuriem ir tendence uzbriest) ar precizitāti līdz 1mg, ievieto iepriekš izkarsētā un nosvērtā tīģelī pārpelnošanai. Tīģeli novieto uz elektriskās plītiņas un pakāpeniski karsē, līdz materiāls pārogļojas. Tīģeli ievieto mufeļkrāsnī, kas noregulēta uz 550 ± 5°C temperatūru. Iztur šajā temperatūrā, līdz iegūst baltus, gaišpelēkus vai sarkanīgas nokrāsas pelnus, kuros nav acīmredzamu ogles daļiņu. Tīģeli ievieto eksikatorā, atdzesē un nekavējoties nosver.
6. Rezultātu aprēķināšana
Atlikuma masu aprēķina, atņemot tīģeļa masu. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
7. Piezīmes
7.1. Grūti pārpelnojamiem materiāliem vispirms veic vismaz trīs stundas ilgu sākotnējo pārpelnošanu, pēc kuras paraugu atdzesē, tam uzmanīgi pievieno dažus pilienus 20% amonija nitrāta šķīduma (raugoties, lai pelni neizkaisītos vai nesaķeptu gabalos). Pēc izžāvēšanas žāvēšanas skapī turpina dedzināšanu. Ja vajadzīgs, šo darbību atkārto, līdz paraugs ir pilnībā pārpelnots;
7.2. Materiālus, kurus nevar apstrādāt tā, kā norādīts 7.1. apakšpunktā, pārpelno šādi: pēc trīs stundas ilgas pārpelnošanas pelnus pārnes siltā ūdenī un filtrē caur nelielu bezpelnu filtru. Tajā pašā tīģelī pārpelno filtru kopā ar atlikumu uz tā. Filtrātu pārnes atdzesētā tīģelī, iztvaicē sausu, pārpelno un nosver;
7.3. Analizējot eļļas un taukus, piemērota izmēra tīģelī precīzi iesver apmēram 25g parauga. Pārogļo, materiālu aizdedzinot ar bezpelnu filtrpapīra strēmeli. Pēc sadedzināšanas samitrina ar iespējami mazu ūdens daudzumu. Izžāvē un pārpelno tā, kā aprakstīts 5. punktā.
Zemkopības ministrs M.Roze
5.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Sālsskābē nešķīstošo koppelnu noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
1.1. Ar šo metodi nosaka sālsskābē nešķīstošu minerālvielu saturu barībā. Atkarībā no parauga īpašībām izmanto A vai B metodi.
1.2. A metode: izmanto vienkāršās organiskās barības un lielākās daļas kombinētās barības veidu analīzēm;
1.3. B metode: izmanto tādas kombinētās minerālbarības, minerālvielu maisījumu un kombinētās barības analīzēm, kuru sālsskābē nešķīstošo pelnu saturs, kas noteikts pēc A metodes, ir lielāks par 1 %.
2. Princips
2.1. A metode: paraugu pārpelno, pelnus vāra sālsskābē, nešķīstošo atlikumu filtrē un sver;
2.2. B metode: paraugu apstrādā ar sālsskābi. Šķīdumu filtrē, atlikumu pārpelno un šādi iegūtos pelnus apstrādā pēc A metodes.
3. Reaģenti
3.1. Sālsskābes 3 n šķīdums;
3.2. Trihloretiķskābes 20 % (m/V) šķīdums;
3.3. Trihloretiķskābes 1 % (m/V) šķīdums.
4. Aparatūra
4.1. Elektriskā plītiņa;
4.2. Termostatējama elektriskā mufeļkrāsns;
4.3. Taisnstūraini (60 × 40 × 25 mm) vai apaļi (60 līdz 70 mm diametrā, augstums no 20 līdz 25 mm) tīģeļi pārpelnošanai no platīna vai platīna un zelta sakausējuma (10 % Pt, 90 % Au).
5. Darba gaita
5.1. A metode
5.1.1. Paraugu pārpelno pēc koppelnu noteikšanai aprakstītās metodes. Var izmantot arī pelnus, kas iegūti, nosakot koppelnu saturu.
5.1.2. Pelnus ar 75 ml 3n sālsskābes šķīduma (3.1.) pārnes uz 250 līdz 400 ml tilpuma vārglāzi. Lēnām uzkarsē līdz viršanas temperatūrai un lēni vāra 15 minūtes. Siltu šķīdumu filtrē caur bezpelnu filtrpapīru un atlikumu mazgā ar siltu ūdeni līdz neitrālai reakcijai. Filtru ar atlikumu izžāvē un nosvērtā tīģelī pārpelno 550 līdz 700°C temperatūrā. Atdzesē eksikatorā un nosver.
5.2. B metode
5.2.1. Ņem 5g lielu parauga iesvaru ar precizitāti līdz 1mg, to pārnes uz 250 līdz 400 ml tilpuma vārglāzi. Pievieno vispirms 25 ml ūdens, tad 25 ml 3 n sālsskābes šķīdumu (3.1.), samaisa un gaida, līdz beidz izdalīties burbuļi. Pievieno vēl 50 ml 3n sālsskābes (3.1.). Nogaida, līdz beidzas gāzu izdalīšanās, tad vārglāzi ievieto verdoša ūdens vannā uz 30 minūtēm, vai ilgāk, lai iespējami pilnīgi hidrolizētu visu cietes daudzumu, kas var būt paraugā.
5.2.2. Siltu šķīdumu filtrē caur bezpelnu filtru un mazgā filtru ar 50 ml silta ūdens (skatīt 7. punktu). Filtru ar atlikumu ieliek nosvērtā tīģelī, izžāvē un pārpelno 550 līdz 700°C temperatūrā. Pelnus ar 75 ml 3n sālsskābes šķīduma (3.1.) pārnes uz 250 līdz 400 ml tilpuma vārglāzi un analīzi turpina tā, kā aprakstīts 5.1.2. apakšpunktā.
6. Rezultātu aprēķināšana
Aprēķina atlikuma masu, atņemot tīģeļa masu. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
7. Piezīme
Ja atlikums filtrējas slikti, analīzi atkārto, 50 ml 3 n sālsskābes šķīduma (3.1.) vietā ņemot 50 ml 20% trihloretiķskābes (3.2.), bet filtru mazgājot ar siltu 1% trihloretiķskābes šķīdumu (3.3.).
Zemkopības ministrs M.Roze
6.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Hlora satura noteikšana hlorīdos
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka hlora saturu ūdenī šķīstošiem hlorīdiem, ko izsaka nātrija hlorīda veidā. To izmanto visu veidu barības analīzēm.
2. Princips
Hlorīdus šķīdina ūdenī. Ja produkts satur organiskās vielas, šķīdumu dzidrina. Šķīdumu nedaudz paskābina ar slāpekļskābi un hlorīdus ar sudraba nitrāta šķīdumu izgulsnē sudraba hlorīda veidā. Sudraba nitrāta pārākumu attitrē ar amonija tiocianāta šķīdumu pēc Volharda metodes.
3. Reaģenti
3.1. Amonija tiocianāta 0,1n šķīdums;
3.2. Sudraba nitrāta 0,1n šķīdums;
3.3. Amonija dzelzs sulfāta piesātināts šķīdums;
3.4. Slāpekļskābe – d: 1.38;
3.5. Dietilēteris – a.t.;
3.6. Acetons – a.t.;
3.7. Kareca I šķīdums: ūdenī izšķīdina 21,9g cinka acetāta Zn (CH3COO)2·2H2O un 3g ledus etiķskābes. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml;
3.8. Kareca II šķīdums: ūdenī izšķīdina 10,6g kālija heksacianoferāta K4[Fe (CN)6]·3H2O. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml;
3.9. Aktīvā ogle – a.t., kas nesatur un neabsorbē hlorīdus.
4. Iekārtas
Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min.
5. Darba gaita
5.1. Šķīduma sagatavošana – atbilstoši parauga īpašībām sagatavo šķīdumu tā, kā aprakstīts 5.1.1., 5.1.2. vai 5.1.3. apakšpunktā. Vienlaikus veic “tukšā” parauga analīzi.
5.1.1. paraugi, kas nesatur organiskās vielas – ar precizitāti līdz miligramam ņem ne vairāk kā 10g iesvara, kurā ir ne vairāk par 3g hlorīdu hlora veidā un iepilda 500 ml mērkolbā, pievieno 400 ml apmēram 20°C siltu ūdeni. Maisa trīsdesmit minūtes maisītājā, uzpilda līdz atzīmei, samaisa un filtrē.
5.1.2. Paraugi, kas satur organiskās vielas, izņemot 5.1.3. punktā uzskaitītos produktus – nosver 5g parauga ar precizitāti līdz 1 mg un kopā ar 1g aktīvās ogles pārnes uz 500 ml mērkolbu. Pievieno 400 ml ūdens ar temperatūru apmēram 20°C un 5 ml Karreza I šķīduma (3.7.), maisa, un tad pievieno 5 ml Karreza II šķīduma (3.8.). Trīsdesmit minūtes maisa maisītājā, uzpilda līdz atzīmei, samaisa un filtrē.
5.1.3. Termiski apstrādāti barības līdzekļi, linu rauši un linu milti, produkti, kuros ir daudz linu miltu, un citi produkti, kuros ir daudz gļotvielu vai koloīdu vielu (piemēram, dekstrinēta ciete). Sagatavo šķīdumu saskaņā ar 5.1.2. punktā doto aprakstu, tikai to nefiltrē. Dekantē (ja vajadzīgs, centrifugē), ņem 100 ml šķidruma no virsējā slāņa, ko pārnes 200 ml mērkolbā. Samaisa ar acetonu (3.6.), kolbu uzpilda līdz atzīmei ar šo šķīdinātāju, samaisa un filtrē.
5.2. Titrēšana
5.2.1. Ar pipeti uz Erlenmeijera kolbu pārnes 25 ml līdz 100 ml filtrāta (atkarībā no gaidāmā hlora satura), ko iegūst saskaņā ar aprakstu 5.1.1., 5.1.2. vai 5.1.3.apakšpunktā. Analīzei ņemtajā šķīduma tilpumā hlora (Cl) daudzumam jābūt ne vairāk par 150 mg. Ja nepieciešams, atšķaida ar vismaz 50 ml ūdens, pievieno 5 ml slāpekļskābes (3.4.), 20 ml piesātināta amonija dzelzs sulfāta šķīduma (3.3.) un divus pilienus amonija tiocianāta šķīduma (3.1.), ko ņem ar bireti, kas uzpildīta līdz nulles atzīmei. Lietojot citu bireti, šķīdumu titrē ar sudraba nitrāta šķīdumu (3.2.), līdz izzūd sarkani brūnā nokrāsa, un tad vēl papildus pievieno 5 ml šī šķīduma (3.2.). Pievieno 5 ml dietilētera (3.5.) un stipri sakrata, lai koagulētu nogulsnes.
5.2.2. Sudraba nitrāta pārākumu titrē ar amonija tiocianāta šķīdumu (3.1.), līdz veidojas sarkanbrūns krāsojums, kas saglabājas vienu minūti.
6. Rezultātu aprēķināšana
Hlora daudzumu (m), ko izsaka kā nātrija hlorīdu, kas ir titrēšanai ņemtajā filtrāta tilpumā, aprēķina pēc šādas formulas:
m = 5,845 (V1 – V2) mg, kur
V1 = pievienotā 0,1 n sudraba nitrāta šķīduma tilpums, ml;
V2 = titrēšanai izlietotais 0,1 n amonija tiocianāta šķīduma tilpums, ml.
Ja “tukšā” parauga titrēšanai ir izlietots 0,1 n sudraba nitrāta šķīdums, atņemiet šo vērtību no tilpuma (V1 – V2).
7. Piezīmes
7.1. var veikt arī potenciometrisku titrēšanu;
7.2. analizējot produktus ar ļoti lielu eļļu un tauku saturu, tos vispirms attauko ar dietilēteri vai petrolēteri;
7.3. analizējot zivju miltus, titrēšanu var izdarīt arī pēc Mora metodes.
Zemkopības ministrs M.Roze
7.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Laktozes noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka laktozes saturu barībā, kurā ir vairāk nekā 0,5 % laktozes.
2. Princips
Cukurus šķīdina ūdenī. Šķīdumu fermentē ar raugu Saccharomyces cerevisiae, kas nešķeļ laktozi. Pēc dzidrināšanas un filtrēšanas laktozes saturu filtrātā nosaka pēc Lufa–Šorla metodes.
3. Reaģenti
3.1. Saccharomyces cerevisiae suspensija: 25g svaiga rauga suspendē 100 ml ūdens. Suspensiju var glabāt ledusskapī ne ilgāk par vienu nedēļu;
3.2. Kareca I šķīdums: ūdenī izšķīdina 21,9g cinka acetāta Zn(CH3COO)2·2H2O un 3g ledus etiķskābes. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml tilpumam;
3.3. Kareca II šķīdums: ūdenī izšķīdina 10,6g kālija heksacianoferāta K4[Fe(CN)6]·3H2O. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml;
3.4. Lufa–Šorla reaģents: uzmanīgi maisot, citronskābes šķīdumu (3.4.2.) pievieno nātrija karbonāta šķīdumam (3.4.3.). Pievieno vara sulfāta šķīdumu (3.4.1.) un papildina ar ūdeni līdz 1 litram. Nostādina līdz nākamajai dienai un filtrē. Pārbauda iegūtā šķīduma normalitāti (Cu 0,1 n; Na2CO3 2n). Šķīduma pH vajadzētu būt apmēram 9,4:
3.4.1. vara sulfāta šķīdums: izšķīdina 25g no dzelzs attīrīta a.t. vara sulfāta CuSO4·5H2O 100 ml ūdens;
3.4.2. citronskābes šķīdums: izšķīdina 50g a.t. citronskābes (C6H8O7·H2O) 50 ml ūdens;
3.4.3. nātrija karbonāta šķīdums: izšķīdina 143,8g bezūdens a.t. nātrija karbonāta apmēram 300 ml silta ūdens, atdzesē;
3.5. Pumeka gabaliņi, kas izvārīti sālsskābē, mazgāti ūdenī un izžāvēti;
3.6. Nātrija jodīda 30 % (m/V) šķīdums;
3.7. Sērskābes 6n šķīdums;
3.8. Nātrija tiosulfāta 0,1n šķīdums;
3.9. Cietes šķīdums: 1 litram vāroša ūdens pievieno 5g šķīstošās cietes maisījuma 30 ml ūdens. Vāra trīs minūtes, atdzesē un, ja vajadzīgs, kā konservantu pievieno 10mg dzīvsudraba jodīda.
4. Aparatūra
Termostatējama ūdens vanna, kas ieregulēta 38–40°C temperatūrā.
5. Darba gaita
5.1. Nosver 1g paraugu ar precizitāti līdz 1 mg un iesvaru pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbu. Pievieno 25 līdz 30 ml ūdens. Kolbu 30 minūtes silda verdoša ūdens vannā un pēc tam atdzesē līdz apmēram 35°C temperatūrai. Pievieno 5 ml rauga suspensijas (3.1.) un homogenizē. Kolbu uz divām stundām ievieto ūdens vannā 38 – 40°C temperatūrā. Atdzesē līdz apmēram 20°C.
5.2. Pievieno 2,5 ml Kareca I šķīduma (3.2.) un maisa 30 sekundes, pēc tam pievieno 2,5 ml Kareca II šķīduma (3.3.) un atkal maisa 30 sekundes. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml, samaisa un filtrē. Ar pipeti ņem ne vairāk par 25 ml filtrāta, kurā vēlams, lai būtu 40 līdz 80 mg laktozes, un to pārnes uz 300 ml tilpuma Erlenmeijera kolbu. Ja vajadzīgs, papildina ar ūdeni līdz 25 ml tilpumam.
5.3. Tādā pašā veidā veic tukšā parauga analīzi ar 5 ml rauga suspensijas (3.1.).
5.4. Pēc Lufa–Šorla metodes nosaka laktozes saturu: pievieno precīzi 25 ml Lufa–Šorla reaģenta (3.4.) un divus pumeka (3.5.) gabaliņus. Uz vidēja augstuma vaļējas liesmas šķīdumu apmēram divās minūtēs uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai, maisa ar roku. Erlenmeijera kolbu nekavējoties novieto uz metāla sieta, kas pārklāts ar azbestu un kam ir apmēram 6 cm liels caurums, zem kura iedegta liesma. Liesmu noregulē tā, lai Erlenmeijera kolba tiktu sildīta tikai no apakšas. Erlenmeijera kolbai pievieno atteces dzesinātāju. Vāra precīzi desmit minūtes. Nekavējoties atdzesē aukstā ūdenī un pēc apmēram piecām minūtēm titrē šādi – pievieno 10 ml kālija jodīda šķīduma (3.6.) un tūlīt pievieno 25 ml sērskābes 6 n šķīduma (3.7.) (uzmanīgi, iespējama ievērojama putu veidošanās). Titrē ar 0,1 n nātrija tiosulfāta šķīdumu (3.8.), līdz parādās blāvi dzeltens krāsojums, pievieno cietes indikatoru (3.9.) un pabeidz titrēšanu.
5.5. Tādā pašā veidā (bez vārīšanas) titrē 25 ml precīzi iemērīta Lufa–Šorla reaģenta (3.4.) un 25 ml ūdens maisījumu, kam pievienoti 10 ml kālija jodīda šķīduma (3.6.) un 25 ml sērskābes 6 n šķīduma (3.7.).
6. Rezultātu aprēķināšana
6.1. Pēc tabulas nosaka laktozes daudzumu mg, kas atbilst divu titrēšanas rezultātu starpībai, ko izsaka 0,1 n nātrija tiosulfāta mililitros.
6.2. Rezultātu izsaka kā bezūdens laktozes masas daļu procentos no parauga masas.
7. Piezīmes
7.1. Tādu produktu analīzēm, kuros ir vairāk par 40 % rūgstošu cukuru, ņem vairāk par 5 ml rauga suspensijas (3.1.).
7.2. 0,1 n Na2S2O3 šķīduma (ml) lielumu tabula 25 ml Lufa–Šorla reaģentam (sildīšana – divas minūtes, vārīšana – desmit minūtes)
|
0,1 n Na2S2O3 |
Glikoze, fruktoze, invertcukuri C6H12O6 |
Laktoze C12H22O11 |
Maltoze C12H22O11 |
0,1 n Na2S2O3 |
|||
|
ml |
mg |
starpība |
mg |
starpība |
mg |
starpība |
ml |
|
1 |
2,4 |
2,4 |
3,6 |
3,7 |
3,9 |
3,9 |
1 |
|
2 |
4,8 |
2,4 |
7,3 |
3,7 |
7,8 |
3,9 |
2 |
|
3 |
7,2 |
2,5 |
11,0 |
3,7 |
11,7 |
3,9 |
3 |
|
4 |
9,7 |
2,5 |
14,7 |
3,7 |
15,6 |
4,0 |
4 |
|
5 |
12,2 |
2,5 |
18,4 |
3,7 |
19,6 |
3,9 |
5 |
|
6 |
14,7 |
2,5 |
22,1 |
3,7 |
23,5 |
4,0 |
6 |
|
7 |
17,2 |
2,6 |
25,8 |
3,7 |
27,5 |
4,0 |
7 |
|
8 |
19,8 |
2,6 |
29,5 |
3,7 |
31,5 |
4,0 |
8 |
|
9 |
22,4 |
2,6 |
33,2 |
3,8 |
35,5 |
4,0 |
9 |
|
10 |
25,0 |
2,6 |
37,0 |
3,8 |
39,5 |
4,0 |
10 |
|
11 |
27,6 |
2,7 |
40,8 |
3,8 |
43,5 |
4,0 |
11 |
|
12 |
30,3 |
2,7 |
44,6 |
3,8 |
47,5 |
4,1 |
12 |
|
13 |
33,0 |
2,7 |
48,4 |
3,8 |
51,6 |
4,1 |
13 |
|
14 |
35,7 |
2,8 |
52,2 |
3,8 |
55,7 |
4,1 |
14 |
|
15 |
38,5 |
2,8 |
56,0 |
3,9 |
59,8 |
4,1 |
15 |
|
16 |
41,3 |
2,9 |
59,9 |
3,9 |
63,9 |
4,1 |
16 |
|
17 |
44,2 |
2,9 |
63,8 |
3,9 |
68,0 |
4,2 |
17 |
|
18 |
47,1 |
2,9 |
67,7 |
4,0 |
72,2 |
4,3 |
18 |
|
19 |
50,0 |
3,0 |
71,7 |
4,0 |
76,5 |
4,4 |
19 |
|
20 |
53,0 |
3,0 |
75,7 |
4,1 |
80,9 |
4,5 |
20 |
|
21 |
56,0 |
3,1 |
79,8 |
4,1 |
85,4 |
4,6 |
21 |
|
22 |
59,1 |
3,1 |
83,9 |
4,1 |
90,0 |
4,6 |
22 |
|
23 |
62,2 |
88,0 |
94,6 |
23 |
|||
Zemkopības ministrs M.Roze
8.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Kālija noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka kālija saturu barībā.
2. Princips
Paraugu pārpelno un izšķīdina sālsskābē. Kālija saturu šķīdumā nosaka ar liesmas fotometru cēzija hlorīda un alumīnija nitrāta klātbūtnē. Pievienojot šīs vielas, tiek ievērojami novērsta traucējošo elementu ietekme.
3. Reaģenti
3.1. Sālsskābe – a.t., d: 1,12;
3.2. Cēzija hlorīds – a.t.;
3.3. Alumīnija nitrāts Al (NO3)3·9H2O – reaģents vispārējai lietošanai;
3.4. Kālija hlorīds – a.t., bezūdens;
3.5. buferšķīdums: ūdenī izšķīdina 50g cēzija hlorīda (3.2.) un 250g alumīnija nitrāta (3.3.), papildina līdz 1 litram ar ūdeni un homogenizē. Uzglabā plastmasas pudelēs;
3.6. Kālija standartšķīdums: ūdenī izšķīdina 1,907g kālija hlorīda (3.4.) un pievieno 5 ml sālsskābes šķīduma (3.1.), uzpilda līdz 1 litram ar ūdeni un homogenizē. Uzglabā plastmasas pudelēs. Šā šķīduma 1 ml satur 1,00mg kālija.
4. Iekārtas
4.1. Platīna, kvarca vai porcelāna tīģeļi pārpelnošanai, kam vajadzības gadījumos uzliek vāciņu;
4.2. Elektriskā mufeļkrāsns ar termostatu;
4.3. Liesmas fotometrs.
5. Darba gaita
5.1. paraugu analīze
5.1.1. Parasti ņem 10g iesvara ar precizitāti līdz 10mg, ko pārnes uz tīģeli, un trīs stundas pārpelno 450°C temperatūrā. Pēc atdzesēšanas pelnus ar 250 līdz 300 ml ūdens kvantitatīvi pārnes uz 500 ml tilpuma mērkolbu un pievieno 50 ml sālsskābes (3.1.). Kad beigusies oglekļa dioksīda izdalīšanās, šķīdumu uzkarsē un, laiku pa laikam samaisot, divas stundas silda apmēram 90°C temperatūrā. Atdzesē, papildina ar ūdeni līdz atzīmei, sakrata un filtrē. Filtrāta alikvoto daļu, kas satur apmēram 1,0 mg kālija, pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbu, pievieno 10,0 ml buferšķīduma (3.5.), uzpilda līdz atzīmei ar ūdeni un samaisa. Ja kālija koncentrācija ir augsta, analizējamo šķīdumu atšķaida pirms buferšķīduma pievienošanas.
5.1.2. Apmēram 10g lielam parauga iesvaram orientējošais atšķaidījums norādīts tabulā.
|
Paredzamais nātrija saturs paraugā (% Na) |
Atšķaidījuma koeficients |
Analīzei izmantotais šķīduma tilpums (ml) |
|
līdz 0,1 |
– |
50 |
|
0,1 līdz 0,5 |
– |
10 |
|
0,5 līdz 1,0 |
– |
5 |
|
1,0 līdz 5,0 |
1 : 10 |
10 |
|
5,0 līdz 10,0 |
1 : 10 |
5 |
|
10,0 līdz 20,0 |
1 : 20 |
5 |
5.1.3. Mērījumus izdara ar liesmas fotometru pie 768 nm. Rezultātus aprēķina pēc kalibrēšanas līknes.
5.2. Kalibrēšanas līkne – precīzi 10 ml standartšķīduma (3.6.) pārnes 250 ml tilpuma mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar ūdeni un samaisa. Precīzi 5, 10, 15, 20 un 25 ml šā šķīduma, kam atbilstošais kālija daudzums ir attiecīgi 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 un 1,0 mg, pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbām. Šo šķīdumu sēriju papildina ar tukšo paraugu, kam standartšķīdumu nepievieno. Visās kolbās pievieno pa 10 ml buferšķīduma (3.5.), ar ūdeni papildina līdz atzīmei un samaisa. Mērījumus veic tā, kā aprakstīts 5.1. apakšpunktā. Kalibrēšanas līknes lineārā daļa parasti ir līdz kālija koncentrācijai 1mg /100 ml šķīduma.
6. Rezultātu aprēķināšana
Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
7. Piezīmes
Traucējošo elementu ietekmes novēršanai ne vienmēr ir jāpievieno šķīdums (3.5.).
Zemkopības ministrs M.Roze
9.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Nātrija noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka nātrija saturu barības līdzekļos.
2. Princips
Paraugu pārpelno un pelnus izšķīdina sālsskābē. Nātrija saturu šķīdumā nosaka ar liesmas fotometru cēzija hlorīda un alumīnija nitrāta klātbūtnē. Pievienojot šīs vielas, tiek ievērojami novērsta traucējošo elementu ietekme.
3. Reaģenti
3.1. Sālsskābe – a.t., d: 1,12;
3.2. Cēzija hlorīds – a.t.;
3.3. Alumīnija nitrāts Al (NO3)3·9H2O – reaģents vispārējai lietošanai;
3.4. Nātrija hlorīds – a.t., bezūdens;
3.5. Buferšķīdums: ūdenī izšķīdina 50g cēzija hlorīda (3.2.) un 250g alumīnija nitrāta (3.3.), papildina līdz 1 litram ar ūdeni un samaisa. Uzglabā plastmasas pudelēs;
3.6. Nātrija standartšķīdums: ūdenī izšķīdina 2,542g nātrija hlorīda (3.4.) un pievieno 5 ml sālsskābes (3.1.), uzpilda līdz 1 litram ar ūdeni un samaisa. Uzglabā plastmasas pudelēs, šā šķīduma 1 ml satur 1,00mg nātrija.
4. Iekārtas
4.1. Platīna, kvarca vai porcelāna tīģeļi pārpelnošanai, kam vajadzības gadījumos uzliek vāciņu;
4.2. elektriskā mufeļkrāsns ar termostatu;
4.3. Liesmas fotometrs.
5. Darba gaita
5.1. Paraugu analīzes
5.1.1. Parasti ņem 10 g iesvara ar precizitāti līdz 10 mg, ko pārnes tīģelī un trīs stundas pārpelno 450°C temperatūrā. Jānovērš pārkarsēšana (degšana). Pēc atdzesēšanas pelnus kvantitatīvi ar 250 līdz 300 ml ūdens pārnes uz 500 ml tilpuma mērkolbu un pievieno 50 ml sālsskābes (3.1.). Kad beigusies oglekļa dioksīda izdalīšanās, šķīdumu uzkarsē un, laiku pa laikam samaisot, divas stundas silda apmēram 90°C temperatūrā. Atdzesē, papildina ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē. Filtrāta alikvoto daļu, kas satur ne vairāk par 1,0 mg nātrija, pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbu, pievieno 10,0 ml buferšķīduma (3.5.), papildina līdz atzīmei ar ūdeni un samaisa. Ja nātrija koncentrācija ir augsta, analizējamo šķīdumu atšķaida pirms buferšķīduma pievienošanas.
5.1.2. Apmēram 10g lielam parauga iesvaram orientējošais atšķaidījums norādīts tabulā.
|
Paredzamais nātrija saturs paraugā (% Na) |
Atšķaidījuma koeficients |
Analīzei izmantotais šķīduma tilpums (ml) |
|
līdz 0,1 |
– |
50 |
|
0,1 līdz 0,5 |
– |
10 |
|
0,5 līdz 1,0 |
– |
5 |
|
1,0 līdz 5,0 |
1 : 10 |
10 |
|
5,0 līdz 10,0 |
1 : 10 |
5 |
|
10,0 līdz 20,0 |
1 : 20 |
5 |
5.1.3. Mērījumus izdara ar liesmas fotometru pie 589nm. Rezultātus aprēķina pēc kalibrēšanas līknes.
5.2. Kalibrēšanas līkne – precīzi 10 ml standartšķīduma (3.6.) pārnes uz 250 ml tilpuma mērkolbu, papildina līdz atzīmei ar ūdeni un samaisa. Precīzi 5, 10, 15, 20 un 25 ml šā šķīduma, kam atbilstošais nātrija daudzums ir attiecīgi 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 un 1,0 mg, pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbām. Šo šķīdumu sēriju papildina ar tukšo paraugu, kam standartšķīdumu nepievieno. Visās kolbās pievieno pa 10 ml buferšķīduma (3.5.), ar ūdeni papildina līdz atzīmei un samaisa. Mērījumus veic tā, kā aprakstīts 5.1. apakšpunktā. Kalibrēšanas līknes lineārā daļa parasti ir līdz nātrija koncentrācijai 1mg /100 ml šķīduma.
6. Rezultātu aprēķināšana
Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
7. Piezīmes
7.1. Produktiem, kuros ir vairāk par 4 % nātrija, ieteicams veikt pārpelnošanu divas stundas tīģelī ar vāciņu. Pēc atdzesēšanas pievieno ūdeni, pelnus ar platīna stiepli suspendē, izžāvē un pārpelno vēl divas stundas tīģelī ar vāciņu
7.2. Ja parauga sastāvā ir tikai minerālvielas, to izšķīdina, iepriekš nepārpelnojot
Zemkopības ministrs M.Roze
10.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Cukura noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka reducējošo cukuru saturu, un, izdarot inversiju, kopējo cukuru saturu, ko izsaka glikozē vai atbilstošos gadījumos saharozē, reizinot ar koeficientu 0,95. Metode izmantojama kombinētās barības analīzēm. Pārējo barības veidu analīzēm ir īpašas metodes. Vajadzības gadījumos laktozi nosaka atsevišķi un ņem vērā rezultātu aprēķinos.
2. Princips
Cukurus ekstrahē ar atšķaidītu etanolu, šķīdumu dzidrina ar Kareca I un Kareca II šķīdumu. Pēc etanola atdalīšanas ar Lufa–Šorla metodi nosaka cukuru daudzumu pirms un pēc inversijas.
3. Reaģenti
3.1. Etilspirts – 40 % V/V, d: 0,948 20°C temperatūrā, neitralizēts pēc fenolftaleīna;
3.2. Kareca I šķīdums: ūdenī izšķīdina 21,9g cinka acetāta (Zn (CH3COO)2·2H2O) un 3g ledus etiķskābes. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml;
3.3. Kareca II šķīdums: ūdenī izšķīdina 10,6g kālija heksacianoferāta (K4[Fe(CN)6]·3H2O). Papildina ar ūdeni līdz 100 ml;
3.4. Metiloranžā 0,1 % (m/V) šķīdums;
3.5. Sālsskābes 4n šķīdums;
3.6. Sālsskābes 0,1n šķīdums;
3.7. Nātrija hidroksīda 0,1n šķīdums;
3.8. Lufa–Šorla reaģents:
Citronskābes šķīdumu (3.8.2.), uzmanīgi maisot, pievieno nātrija karbonāta šķīdumam (3.8.3.). Pievieno vara sulfāta šķīdumu (3.8.1.) un papildina ar ūdeni līdz 1 litram. Nostādina līdz nākamajai dienai un filtrē. Pārbauda iegūtā šķīduma normalitāti (Cu 0,1n, Na2CO3 2n). Šķīduma pH vajadzētu būt apmēram 9,4.
3.8.1. Vara sulfāta šķīdums: 25g no dzelzs attīrīta a.t. vara sulfāta (CuSO4·5H2O) izšķīdina 100 ml ūdens;
3.8.2. Citronskābes šķīdums: 50g a.t. citronskābes (C6H8O7·H2O) izšķīdina 50 ml ūdens;
3.8.3. Nātrija karbonāta šķīdums: 143,8g bezūdens a.t. nātrija karbonāta izšķīdina apmēram 300 ml silta ūdens un atdzesē;
3.9. Nātrija tiosulfāta 0,1n šķīdums;
3.10. Cietes šķīdums: 1 litram vāroša ūdens pievieno 5g šķīstošās cietes maisījuma 30 ml ūdens. Vāra trīs minūtes, atdzesē un, ja vajadzīgs, kā konservantu pievieno 10mg dzīvsudraba jodīda;
3.11. Sērskābes 6n šķīdums;
3.12. Kālija jodīda 30 % (m/V) šķīdums;
3.13. Pumeka gabaliņi, kas izvārīti sālsskābē, mazgāti ūdenī un izžāvēti;
3.14. 3–metil–butān–1–ols.
4. Aparatūra
Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min.
5. Darba gaita
5.1. Parauga ekstrakcija – 2,5g lielu parauga iesvaru ar precizitāti līdz 1 mg pārnes 250 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno 200 ml etanola šķīduma (3.1.) un vienu stundu maisa maisītājā. Pievieno 5 ml Kareca I šķīduma (3.2.) un maisa vienu minūti. Pievieno 5 ml Kareca II šķīduma (3.3.) un maisa vēl vienu minūti. Uzpilda ar etilspirta šķīdumu (3.1.) līdz atzīmei, samaisa un filtrē. Ņem 200 ml filtrāta un, lai atdalītu lielāko daļu etanola, ietvaicē apmēram uz pusi. Ietvaicēto šķīdumu ar siltu ūdeni kvantitatīvi pārnes 200 ml tilpuma mērkolbā, atdzesē, papildina ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē, ja nepieciešams. Šo šķīdumu izmantos reducējošo cukuru un (pēc inversijas) arī kopējo cukuru daudzuma noteikšanai.
5.2. Reducējošo cukuru noteikšana – ar pipeti ņem ne vairāk par 25 ml šķīduma, kurā, izsakot glikozē, ir ne vairāk kā 60mg reducējošo cukuru. Ja vajadzīgs, tilpumu papildina ar ūdeni līdz 25 ml un nosaka reducējošos cukurus pēc Lufa–Šorla metodes. Rezultātu izsaka kā glikozes masas daļu procentos no parauga masas.
5.3. Kopējā cukuru satura noteikšana pēc inversijas – ar pipeti ņem 50 ml šķīduma, ko pārnes 100 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno dažus pilienus metiloranžā šķīduma (3.4.) un pēc tam, nepārtraukti maisot, uzmanīgi pievieno 4n sālsskābes šķīdumu (3.5.), līdz šķidrums kļūst izteikti sarkans. Pievieno 15 ml 0,1n sālsskābes šķīdumu (3.6.) un kolbu uz trīsdesmit minūtēm strauji ievieto verdošā ūdens vannā. Ātri atdzesē līdz aptuveni 20°C temperatūrai un pievieno 15 ml 0,1n nātrija hidroksīda šķīduma (3.7.). Papildina ar ūdeni līdz 100 ml un samaisa. Ar pipeti ņem ne vairāk par 25 ml šķīduma, kurā, izsakot glikozē, ir ne vairāk par 60mg reducējošo cukuru. Ja vajadzīgs, tilpumu papildina ar ūdeni līdz 25 ml un nosaka reducējošos cukurus pēc Lufa–Šorla metodes. Rezultātu izsaka glikozes vai, ja vajadzīgs, saharozes procentos, reizinot ar koeficientu 0,95.
5.4. Titrēšana pēc Lufa–Šorla metodes
5.4.1. Ar pipeti ņem 25 ml Lufa–Šorla reaģenta (3.8.), ko pārnes 300 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā, pievieno precīzi 25 ml dzidrināta cukura šķīduma. Pievieno divus gabaliņus pumeka (3.13.) un, ar roku maisot, uz vidēja augstuma vaļējas liesmas šķīdumu apmēram divās minūtēs uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai. Erlemneijera kolbu nekavējoties novieto uz metāla sieta, kas pārklāts ar azbestu un kuram ir caurums apmēram 6 cm diametrā, zem kura iedegta liesma. Liesmu noregulē tā, lai Erlenmeijera kolba tiktu sildīta tikai no apakšas. Erlenmeijera kolbai pievieno atteces dzesinātāju. Vāra precīzi desmit minūtes. Nekavējoties atdzesē aukstā ūdenī un apmēram pēc piecām minūtēm titrē šādi.
5.4.2. Pievieno 10 ml kālija jodīda šķīdumu (3.12.) un tūlīt pēc tam pievieno 25 ml 6n sērskābes šķīdumu (3.11.) (uzmanīgi, iespējama ievērojama putu veidošanās). Titrē ar 0,1n nātrija tiosulfāta šķīdumu (3.9.), līdz parādās blāvi dzeltens krāsojums, pievieno cietes indikatoru (3.10.) un pabeidz titrēšanu.
5.4.3. Bez vārīšanas tādā pašā veidā titrē 25 ml precīzi mērīta Lufa–Šorla reaģenta (3.8.) un 25 ml ūdens maisījuma, kam pievienoti 10 ml kālija jodīda šķīduma (3.12.) un 25 ml 6n sērskābes šķīduma (3.11.).
6. Rezultātu aprēķināšana
Pēc tabulas nosaka glikozes daudzumu mg, kas atbilst divu titrēšanas rezultātu starpībai, ko izsaka 0,1n nātrija tiosulfāta mililitros. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
7. Īpašas procedūras
7.1. Ja analizē barību, kurā ir daudz melases, kā arī citu veidu barību, kas nav īpaši viendabīga, ņem 20g lielu iesvaru, ko ar 500 ml ūdens pārnes 1 l tilpuma mērkolbā. Vienu stundu maisa maisītājā. Dzidrina, izmantojot Kareca I (3.2.) un Kareca II (3.3.) šķīdumus pēc 5.1. apakšpunktā sniegtā apraksta, abus reaģentus ņemot četrreiz lielākā daudzumā. Uzpilda līdz atzīmei ar 80 % V/V etanolu. Samaisa un filtrē. Atdala etanolu pēc 5.1. apakšpunktā sniegtā apraksta. Ja paraugā nav dekstrīnā pārvērstas cietes, uzpilda līdz atzīmei ar ūdeni.
7.2. Analizējot melasi un vienkāršo barību, kurā ir daudz cukuru un kas tikpat kā nesatur cieti (ceratonijas, žāvēti biešu graizījumi u.c.), ņem 5g iesvara un pārnes 250 ml tilpuma mērkolbā, pievieno 200 ml ūdens un vienu stundu, bet, ja vajadzīgs, arī ilgāk, maisa maisītājā. Dzidrina ar Kareca I (3.2.) un Kareca II (3.3.) šķīdumiem pēc 5.1. apakšpunktā sniegtā apraksta. Uzpilda ar aukstu ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē. Lai noteiktu kopējo cukuru saturu, analīzi turpina pēc 5.3. apakšpunktā sniegtā apraksta.
8. Piezīmes
8.1. Pirms vārīšanas ar Lufa–Šorla reaģentu putošanās novēršanai ieteicams pievienot (neatkarīgi no tilpuma) apmēram 1 ml 3–metil–butān–1–ola (3.14.);
8.2. Pēc glikozē izteiktā kopējo cukuru daudzuma, ko nosaka pēc inversijas, un glikozē izteiktā reducējošo cukuru daudzuma starpības, ko reizina ar koeficientu 0,95, nosaka saharozes saturu;
8.3. Reducējošos cukurus, izņemot laktozi, var noteikt pēc divām metodēm:
8.3.1. aptuvenu aprēķinu – laktozes saturu reizina ar koeficientu 0,675, kas noteikts pēc citas metodes, un iegūto rezultātu atņem no reducējošo cukuru satura;
8.3.2. precīzu aprēķinu – nosakot reducējošo cukuru, izņemot laktozi, vienam paraugam veic divas analīzes. Vienai analīzei ņem daļu šķīduma, kas iegūts saskaņā ar 5.1. apakšpunktā sniegto aprakstu, bet otrai analīzei – daļu šķīduma, ko iegūst pēc laktozes noteikšanas metodes (pēc citu cukuru fermentācijas un dzidrināšanas).
Abos gadījumos cukuru saturu nosaka pēc Lufa–Šorla metodes un aprēķina mg glikozes. No viena lieluma atņem otru un starpību izsaka procentos no parauga masas.
Piemērs
Divi abām analīzēm ņemto šķīdumu tilpumi atbilst 250mg paraugam.
Pirmajā gadījumā patērēti 17 ml 0,1n nātrija tiosulfāta šķīduma, kas atbilst 44,2mg glikozes; otrajā – 11 ml, kas atbilst 27,6mg glikozes.
Starpība ir 16,6mg glikozes.
Tāpēc reducējošo cukuru (izņemot laktozi) saturs, pārrēķinot glikozē, ir:
4 x 16,6 = 6,64%
___________
10
0,1n Na2S2O3 šķīduma (ml) lielumu tabula 25 ml Lufa–Šorla reaģentam (sildīšana – divas minūtes, vārīšana – desmit minūtes)
|
0,1n Na2S2O3 |
Glikoze, fruktoze, invertcukuri C6H12O6 |
Laktoze C12H22O11 |
Maltoze C12H22O11 |
0,1n Na2S2O3 |
|||
|
ml |
mg |
starpība |
mg |
starpība |
mg |
starpība |
ml |
|
1 |
2,4 |
2,4 |
3,6 |
3,7 |
3,9 |
3,9 |
1 |
|
2 |
4,8 |
2,4 |
7,3 |
3,7 |
7,8 |
3,9 |
2 |
|
3 |
7,2 |
2,5 |
11,0 |
3,7 |
11,7 |
3,9 |
3 |
|
4 |
9,7 |
2,5 |
14,7 |
3,7 |
15,6 |
4,0 |
4 |
|
5 |
12,2 |
2,5 |
18,4 |
3,7 |
19,6 |
3,9 |
5 |
|
6 |
14,7 |
2,5 |
22,1 |
3,7 |
23,5 |
4,0 |
6 |
|
7 |
17,2 |
2,6 |
25,8 |
3,7 |
27,5 |
4,0 |
7 |
|
8 |
19,8 |
2,6 |
29,5 |
3,7 |
31,5 |
4,0 |
8 |
|
9 |
22,4 |
2,6 |
33,2 |
3,8 |
35,5 |
4,0 |
9 |
|
10 |
25,0 |
2,6 |
37,0 |
3,8 |
39,5 |
4,0 |
10 |
|
11 |
27,6 |
2,7 |
40,8 |
3,8 |
43,5 |
4,0 |
11 |
|
12 |
30,3 |
2,7 |
44,6 |
3,8 |
47,5 |
4,1 |
12 |
|
13 |
33,0 |
2,7 |
48,4 |
3,8 |
51,6 |
4,1 |
13 |
|
14 |
35,7 |
2,8 |
52,2 |
3,8 |
55,7 |
4,1 |
14 |
|
15 |
38,5 |
2,8 |
56,0 |
3,9 |
59,8 |
4,1 |
15 |
|
16 |
41,3 |
2,9 |
59,9 |
3,9 |
63,9 |
4,1 |
16 |
|
17 |
44,2 |
2,9 |
63,8 |
3,9 |
68,0 |
4,2 |
17 |
|
18 |
47,1 |
2,9 |
67,7 |
4,0 |
72,2 |
4,3 |
18 |
|
19 |
50,0 |
3,0 |
71,7 |
4,0 |
76,5 |
4,4 |
19 |
|
20 |
53,0 |
3,0 |
75,7 |
4,1 |
80,9 |
4,5 |
20 |
|
21 |
56,0 |
3,1 |
79,8 |
4,1 |
85,4 |
4,6 |
21 |
|
22 |
59,1 |
3,1 |
83,9 |
4,1 |
90,0 |
4,6 |
22 |
|
23 |
62,2 |
88,0 |
94,6 |
23 |
|||
Zemkopības ministrs M.Roze
11.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Urīnvielas noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka urīnvielas saturu barībā.
2. Princips
Paraugu kopā ar dzidrināšanas reaģentu iejauc ūdenī. Suspensiju filtrē. Urīnvielas saturu filtrātā nosaka pēc 4–dimetilaminobenzaldehīda (4–DMAB) pievienošanas, ar spektrofotometru mērot optisko blīvumu pie 420 nm.
3. Reaģenti
3.1. 4–dimetilaminobenzaldehīda šķīdums: izšķīdina 1,6 g 4–DAMB 100 ml 96% etanola un pievieno 10 ml tīra analīzei (a.t.). sālsskābes (d: 1,19). Šo reaģentu var glabāt ne ilgāk par divām nedēļām;
3.2. Karreza I šķīdums: ūdenī izšķīdina 21,9 g cinka acetāta Zn(CH3COO)2·2H2O un 3 g ledus etiķskābes. Papildina ar ūdeni līdz 100 m;l
3.3. Karreza II šķīdums: ūdenī izšķīdina 10,6 g kālija dzelzs cianīda K4[Fe(CN)6]·3H2O. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml;
3.4. aktīvā ogle – a.t., kas neabsorbē urīnvielu (jāpārbauda);
3.5. urīnvielas šķīdums a.t., 0,1 % masa/tilpums (m/v).
4. Iekārtas
4.1. rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min.;
4.2. mēģenes: 160 × 16 mm ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem;
4.3. spektrofotometrs.
5. Darba gaita
5.1. Parauga analīze
5.1.1. Nosver 2 g parauga ar precizitāti līdz vienam miligramam un kopā ar 1 g aktīvās ogles (3.4.) pārnes uz 500 ml mērkolbu. Pievieno 400 ml ūdens un pa 5 ml Karreza I šķīduma (3.2.) un Karreza II šķīduma (3.3.). 30 minūtes maisa maisītājā. Uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē.
5.1.2. Ņem 5 ml caurspīdīgā bezkrāsas filtrāta, pārnes uz mēģeni ar pieslīpēta stikla aizbāzni, pievieno 5 ml 4–DMAB šķīduma (3.1.) un samaisa. Mēģeni ievieto ūdens vannā 20°C temperatūrā. Pēc piecpadsmit minūtēm ar spektrofotometru pie 420 nm mēra parauga šķīduma optisko blīvumu. Salīdzina ar “tukšā” parauga šķīdumu.
5.2. Kalibrēšanas līkne:
5.2.1. Ņem pa 1, 2, 4, 5 un 10 ml urīnvielas šķīduma (3.5.), pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbām un papildina ar ūdeni līdz atzīmei;
5.2.2. Ņem 5 ml no katra šķīduma, pievieno pa 5 ml 4–DMAB šķīduma (3.1.), samaisa un iepriekš aprakstītajā veidā mēra optisko blīvumu pret kontrolšķīdumu, kas sastāv no 5 ml 4–DMAB un 5 ml ūdens, kurš nesatur urīnvielu. Konstruē kalibrēšanas līkni.
6. Rezultātu aprēķināšana
Pēc kalibrēšanas līknes nosaka urīnvielas daudzumu paraugā. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
7. Piezīmes
7.1. Ja urīnvielas saturs ir lielāks par 3 %, iesvaru samazina līdz 1 g vai sākotnēji pagatavoto šķīdumu atšķaida tā, lai 500 ml nebūtu vairāk par 50mg urīnvielas;
7.2. Ja urīnvielas saturs ir zems, parauga iesvara masu palielina, ievērojot nosacījumu, ka no tā iegūtais filtrāts ir caurspīdīgs un bezkrāsains;
7.3. Ja paraugs satur tādus vienkāršus slāpekļa savienojumus kā aminoskābes, optisko blīvumu mēra pie 435nm.
Zemkopības ministrs M.Roze
12.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Ureāzes aktivitātes noteikšana sojas produktos
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka ureāzes aktivitāti sojas produktos un to, vai šie produkti ir pietiekami ilgi termiski apstrādāti.
2. Princips
Ureāzes aktivitāti nosaka pēc amonjaka slāpekļa daudzuma, kas uz 1g produkta 30°C temperatūrā vienas minūtes laikā izdalās no urīnvielas šķīduma.
3. Reaģenti
3.1. 0,1n sālsskābes šķīdums;
3.2. 0,1n nātrija hidroksīda šķīdums;
3.3. Fosfātu 0,05 M buferšķīdums, kurā uz 1000 ml ir 4,45 g nātrija hidrogēnfosfāta (Na2HPO4·2H2O) un 3,40 g kālija dihidrogēnfosfāta (KH2PO4);
3.4. Svaigi pagatavots urīnvielas buferšķīdums, kurā uz 1000 ml buferšķīduma (3.3.) ir 30,0 g urīnvielas; pH 6,9–7,0
4. Aparatūra
4.1. Potenciometriskās titrēšanas iekārta vai augstas jutības pH–metrs (0,02 pH) ar magnētisko maisītāju;
4.2. Termostatējama ūdens vanna, kas ieregulēta 30°C temperatūrā;
4.3. Mēģenes (150 × 18 mm) ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem.
5. Darba gaita
5.1. Sasmalcina apmēram 20 g parauga (piemēram, kafijas dzirnaviņās) tā, lai to var izsijāt caur 0,2 mm lielu acu sietu. Ņem 0,2 g sasmalcinātā parauga iesvara ar precizitāti līdz 1 mg, to pārnes uz mēģeni ar pieslīpēta stikla aizbāzni un pievieno 10 ml urīnvielas buferšķīduma (3.4.). Mēģeni nekavējoties noslēdz ar aizbāzni un enerģiski krata. Mēģeni precīzi uz 30 minūtēm ievieto ūdens vannā, kas noregulēta uz 30°C temperatūru. Nekavējoties pievieno 10 ml sālsskābes 0,1 n šķīduma (3.1.), strauji atdzesē līdz 20°C un mēģenes saturu, divreiz skalojot ar 5 ml ūdens, kvantitatīvi pārnes titrēšanas traukā. Ar stikla elektrodu (4.1.) elektrometriski ar 0,1 n nātrija hidroksīda šķīdumu (3.2.) nekavējoties un ātri titrē līdz pH 4,7.
5.2. Tukšo paraugu analizē šādi – ņem 0,2 g sasmalcinātā parauga iesvara ar precizitāti līdz mg, ko ātri pārnes uz mēģeni ar pieslīpēta stikla aizbāzni, pievieno 10 ml 0,1 n sālsskābes šķīduma (3.1.) un 10 ml urīnvielas buferšķīduma (3.4.). Mēģeni nekavējoties atdzesē ledus ūdenī, kur to tur 30 minūtes. Iepriekš norādītajos apstākļos mēģenes saturu pārnes traukā titrēšanai, lietojot 0,1 n nātrija hidroksīda šķīdumu (3.2.) līdz pH 4,7.
6. Aprēķins
Ureāzes aktivitāti aprēķina pēc formulas:
mgN
1 · 4(b – a)
––––– pie 30°C = ––––––––,
g min
30 · E
kur
a = parauga titrēšanai patērētais 0,1 n nātrija hidroksīda šķīduma tilpums mililitros
b = tukšajam paraugam patērētais 0,1 n nātrija hidroksīda šķīduma tilpums mililitros
E = parauga masa gramos
7. Piezīmes
7.1. Šī metode piemērota ureāzes aktivitātes noteikšanai līdz 1 mgN/g*min. 30°C temperatūrā. Produktiem ar augstāku ureāzes aktivitāti parauga iesvaru var samazināt līdz 50 mg
7.2. Produkti, kas satur vairāk par 10% tauku, vispirms aukstumā jāattauko
Zemkopības ministrs M.Roze
13.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Mitruma noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
1.1. Ar šo metodi nosaka mitruma saturu barībā.
1.2. Eiropas Padomes Regulā Nr. 136/66/EEK definēto eļļas sēklu un eļļas augļu analīzes neveic ar šo metodi. Ar šo metodi neizmeklē arī piena produktus, minerālvielas un minerālbarību.
1.3. Eļļas sēklu un eļļas augu mitruma satura noteikšana ir aprakstīta Eiropas Komisijas Regulas Nr. 1470/682 III pielikumā.
2. Princips
Paraugu žāvē atkarībā no barības sastāva. Masas zudumus nosaka sverot. Ja analizē cietu barību, kurai ir augsts mitruma saturs, tad veic sākotnējo žāvēšanu.
3. Iekārtas
3.1. Malšanai izmanto dzirnavas no materiāla, kas neabsorbē mitrumu un ir viegli tīrāms, veic ātru, vienmērīgu sasmalcināšanu, neradot būtisku parauga sakaršanu. Dzirnavām ,kas novērš saskari ar apkārtējo gaisu un atbilst 4.1.1., 4.1.2. apakšpunktā minētajām prasībām (piemēram, āmurveida dzirnavas vai dzirnavas ar ūdens dzesēšanu, konusveida dzirnavas, dzirnavas ar palēninātu zobratu apgriezienu skaitu);
3.2. Analītiskie svari ar precizitāti līdz 0,5 mg;
3.3. Sausi nerūsējoša metāla vai stikla trauki (konteineri) ar vākiem, kas nodrošina to hermētisku noslēgšanu. Trauku žāvēšanas virsmai jānodrošina analizējamā parauga biezums aptuveni 0,3 g/cm² slānī;
3.4. Žāvēšanas skapis (± 1°C) ar pienācīgu ventilāciju un ātru temperatūras regulēšanu (3);
3.5. Regulējama elektriskā vakuumkrāsns, kas aprīkota ar eļļas sūkni un mehānismu karsta, sausa gaisa vai žāvējoša aģenta (piemēram, kalcija oksīds) ievadīšanai;
3.6. Eksikators, kas nodrošina efektīvu mitruma uzsūkšanu.
4. Darba gaita
Piezīme. Šajā sadaļā aprakstītās darbības ir jāveic tūlīt pēc paraugu iepakojuma atvēršanas. Analīzes jāatkārto vismaz divas reizes.
4.1. Parauga sagatavošana:
4.1.1. neattiecas uz to barību, kas minēta 4.1.2. un 4.1.3.apakšpunktā. Ņem vismaz 50 g parauga. Pēc vajadzības sasmalcina vai sadala tā, lai izvairītos no mitruma satura izmaiņām (skatīt 6. punktu);
4.1.2. graudi un putraimi;
4.1.2.1. Ņem vismaz 50 g parauga. To samaļ tā, ka vismaz 50% no maluma izsijājas caur 0,5 mm sietu un atlikums 1 mm sietā nepārsniedz 10%.
4.1.2.2. Graudu, miltu, putraimu un rupja maluma miltus žāvē krāsnī, kuras siltumspēja ir tāda, lai pēc tam, kad to noregulē uz 131°C un vienlaicīgai žāvēšanai ievieto maksimālo analizējamo paraugu skaitu, norādītā temperatūra tiek sasniegta 45 minūtēs. Žāvēšanas krāsns ventilācijai jābūt tādai, lai atšķirība starp rezultātiem, kas iegūti, žāvējot kviešu paraugus pie pilna krāsns noslogojuma divas stundas, un rezultātiem, kas iegūti pēc četru stundu žāvēšanas, būtu mazāka par 0,15 %.
4.1.3. šķidra vai pastveida formas barība un barība, kas galvenokārt sastāv no eļļām un taukiem.
Ņem aptuveni 25 g parauga, nosver ar precizitāti līdz 10 mg, pievieno atbilstošu daudzumu sausas smilts, kas nosvērta ar precizitāti līdz 10 mg un samaisa, kamēr iegūst viendabīgu produktu.
4.2. Žāvēšana
4.2.1. barības līdzekļi, izņemot 4.2.2. un 4.2.3.apakšpunktā minētos;
Nosver trauku (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā traukā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g parauga un izlīdzina. Trauku ar atvērtu vāku ieliek krāsnī, kas iepriekš sakarsēta līdz 103°C. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, trauku tajā ievieto pēc iespējas ātrāk. Paraugu žāvē četras stundas, skaitot no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 103°C. Traukam uzliek vāku, izņem to no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg. Barību, kuras sastāvā galvenokārt ir eļļas un tauki, žāvē krāsnī vēl papildu 30 minūtes 130°C temperatūrā. Mitruma saturs paraugā starp diviem mērījumiem nedrīkst pārsniegt 0,1%.
4.2.2. graudaugi, milti, putraimi un rupja maluma milti;
Nosver trauku (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā traukā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g samalta parauga un izlīdzina. Trauku ar atvērtu vāku ieliek krāsnī, kas iepriekš sakarsēta līdz 130°C. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, trauku tajā ievieto pēc iespējas ātrāk. Paraugu žāvē divas stundas, skaitot no brīža, kad krāsns temperatūra sasniedz 130°C. Traukam uzliek vāku, izņem to no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6. punkts) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg.
4.2.3. barības līdzekļi, kas satur vairāk kā 4% saharozes vai laktozes (piemēram, augļi, hidrolizēti graudaugu produkti, iesala asni, kaltēti biešu graizījumi, zivju buljons un cukuru sīrupi), barība, kas satur vairāk kā 25% minerālsāļu, ieskaitot kristalizācijas ūdeni.
4.2.3.1. Nosver trauku (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā traukā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g parauga un izlīdzina. Trauku ar atvērtu vāku ieliek vakuuma krāsnī (3.5.), kas iepriekš sakarsēta līdz 80°C – 85°C. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, trauku tajā ievieto pēc iespējas ātrāk.
4.2.3.2. Žāvējamā krāsnī palielina spiedienu līdz 0,13 atmosfērām (100 tor) un pie šāda spiediena paraugu žāvē četras stundas – vai nu karsta, sausa gaisa plūsmā vai, izmantojot vielu, kas uzsūc mitrumu (aptuveni 300 g uz 20 paraugiem). Izmantojot otro metodi, pēc paredzētā spiediena sasniegšanas vakuuma sūkni atvieno. Žāvēšanas laiku skaita no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 80°C līdz 85°C. Krāsnī uzmanīgi atjauno atmosfēras spiedienu. Krāsni atver, traukam nekavējoties uzliek vāku, izņem trauku no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg. Tad turpina parauga žāvēšanu 30 minūtes vakuuma krāsnī pie 80°C līdz 85°C un vēlreiz nosver. Mitruma saturs paraugā starp abiem svērumiem nedrīkst pārsniegt 0,1 %.
4.3. Sākotnējā žāvēšana:
4.3.1. barības līdzekļi, izņemot tos, kas minēti 4.3.2.apakšpunktā;
Sākotnēji žāvē barības līdzekļus ar augstu mitruma saturu, kurus grūti samalt: 50 g nesasmalcināta parauga (ja nepieciešams, presētu vai aglomerētu barību var nedaudz sasmalcināt) ar precizitāti līdz 10 mg iesver piemērotā traukā (piemēram, 20 × 12 cm alumīnija trauks ar 0,5 cm apmali). Žāvē krāsnī pie 60°C līdz 70°C temperatūrā, kamēr mitruma saturs ir samazinājies līdz 8% – 12%. Trauku izņem no krāsns, atdzesē vienu stundu laboratorijā, noņemot vāku, un nosver ar precizitāti līdz 10 mg. Nekavējoties samaļ, kā norādīts 4.1.1. apakšpunktā, un žāvē kā norādīts 4.2.1. vai 4.2.3. apakšpunktā atkarībā no barības sastāva.
4.3.2. graudaugi;
Graudus, kuru mitruma saturs pārsniedz 17%, sākotnēji žāvē šādi: 50 g nemaltu graudu ar precizitāti līdz 10 mg iesver piemērotā traukā (piemēram, 20 x 12 cm alumīnija trauks ar 0,5 cm apmali). Žāvē krāsnī 5 līdz 7 minūtes pie 130°C. Izņem no krāsns, atdzesē laboratorijā divas stundas, noņemot vāku, un nosver ar precizitāti līdz 10 mg. Nekavējoties samaļ, kā norādīts 4.1.2. apakšpunktā, un žāvē, kā norādīts 4.2.2. apakšpunktā.
5. Rezultātu aprēķināšana
Mitruma saturu paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:
5.1. Žāvēšana bez sākotnējās žāvēšanas:
100
(E – m) · ––––,
E
kur
E = analizējamā parauga sākotnējā masa gramos
m = izžāvētā analizējamā parauga masa gramos
5.2. Žāvēšana ar sākotnēju žāvēšanu:
kur
E = analizējamā parauga sākotnējā masa gramos
M = analizējamā parauga masa gramos pēc sākotnējās kaltēšanas
M’ = analizējamā parauga masa gramos pēc sasmalcināšanas vai samalšanas
m = izkaltētā analizējamā parauga masa gramos
Rezultātus izsaka procentos.
5.3. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 0,2% mitruma.
6. Piezīmes
Ja ir vajadzīga parauga malšana un ja tās rezultātā mainās produkta mitruma saturs, barības sastāvdaļu analīzes rezultāti ir jākoriģē, pamatojoties uz parauga mitruma saturu tā sākotnējā stāvoklī.
Zemkopības ministrs M.Roze
14.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Gaistošo slāpekļa bāzu noteikšana
1. Mikrodifūzijas metode
1.1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka gaistošo slāpekļa bāžu saturu barībā. Rezultātu izsaka kā amonjaku.
1.2. Princips
Paraugu ekstrahē ar ūdeni un šķīdumu dzidrina un filtrē. Gaistošās slāpekļa bāzes atdala mikrodifūzijas ceļā, izmantojot kālija karbonāta šķīdumu, kas tiek uztverts borskābes šķīdumā un titrēts ar sērskābi.
1.3. Reaģenti
1.3.1. 20% trihloretiķskābes šķīdums – masa/tilpums,(m/v);
1.3.2. Indikators: 33mg bromkrezolzaļā un 65mg metilsarkanā izšķīdina 100 ml 95 % –96 % (v/v) etanola;
1.3.3. Borskābes šķīdums: 1 litra mērkolbā ielej 200 ml 95 % –96 % etanola, 700 ml ūdens un izšķīdina 10g borskābes– analītiski tīrs (a.t.). Pievieno 10 ml indikatora (1.3.2.). Sajauc un pēc vajadzības koriģē šķīduma krāsu līdz gaiši sarkanai, pievienojot nātrija hidroksīdu. 1 ml šā šķīduma nofiksēs līdz 300 mg amonjaka (NH3);
1.3.4. Piesātināts kālija karbonāta šķīdums: 10.0g kālija karbonāta (a.t.) izšķīdina 100 ml vāroša ūdens. Atdzesē un filtrē;
1.3.5. Sērskābe 0,02n.
1.4. Iekārtas
1.4.1. Mikseris (maisītājs) – aptuveni 35 līdz 40 apgr /min.;
1.4.2. Stikla vai plastmasas Konveja trauks;
1.4.3. Mikrobiretes – graduējums 1/100 ml.
1.5. Darba gaita
1.5.1. Nosver 10g parauga ar precizitāti līdz 1mg un kopā ar 100 ml ūdens pārnes uz 200 ml mērkolbu. Maisa maisītājā 30 minūtes. Pievieno 50 ml trihloretiķskābes šķīduma (1.3.1.), papildina līdz atzīmei ar ūdeni, spēcīgi sakrata un izfiltrē caur kroku filtru.
1.5.2. Ar pipeti Konveja trauka centrā iepilina 1 ml borskābes šķīduma (1.3.3.) un 1 ml parauga filtrāta trauka ārējā lokā. Trauku daļēji nosedz ar ieziestu vāku. 1 ml piesātināta kālija karbonāta šķīduma (1.3.4.) ātri iepilina ārējā lokā un aizver vāku, hermētiski noslēdzot trauku. Trauku uzmanīgi griež, lai tas rotētu horizontālā plaknē un abi reaģenti sajauktos. Inkubācija turpinās vismaz četras stundas istabas temperatūrā vai vienu stundu 40°C temperatūrā.
1.5.3. Izmantojot mikrobireti (1.4.3.), gaistošās bāzes titrē borskābes šķīdumā ar 0,02n sērskābes (1.3.5.).
1.5.4. Veic “tukšo” analīzi, izmantojot to pašu procedūru bez analizējamā parauga.
1.6. Rezultātu aprēķināšana
1 ml 0,02n H2SO4 atbilst 0,34mg amonjaka. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
1.7. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
10% no relatīvā lieluma, ja amonjaka saturs ir mazāks par 1,0%
0,1 % no absolūtā lieluma, ja amonjaka saturs ir lielāks par 1,0%
1.8. Piezīmes
Sākotnējo filtrātu atšķaida, ja amonjaka saturs paraugā pārsniedz 0,6 %.
2. Destilēšana
2.1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka gaistošo slāpekļa bāzu saturu zivju miltos, kas praktiski nesatur urīnvielu, izteiktu kā amonjaku. To piemēro tikai tad, ja amonjaka saturs paraugā ir mazāks par 0,25 %.
2.2. Princips
Paraugu ekstrahē ar ūdeni, šķīdumu dzidrina un filtrē. Gaistošās slāpekļa bāzes atdala viršanas temperatūrā, pievienojot magnija oksīdu, savāc konkrētā sērskābes daudzumā, kuras pārpalikumu attitrē ar nātrija hidroksīda šķīdumu.
2.3. Reaģenti
2.3.1. 20% (m/v) trihloretiķskābes šķīdums;
2.3.2. Magnija oksīds (a.t.);
2.3.3. Putu dzēšanas emulsija (piemēram, silikons);
2.3.4. Sērskābe 0,1 n;
2.3.5. Nātrija hidroksīda šķīdums 0,1 n;
2.3.6. 0,3 % (m/v) metilsarkanā šķīduma 95 % –96 % (v/v) etanolā.
2.4. Iekārtas
2.4.1. Mikseris (maisītājs): aptuveni 35 līdz 40 apgr./min.;
2.4.2. Kjeldāla tipa destilēšanas iekārta.
2.5. Darba gaita
2.5.1. Nosver 10 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg un kopā ar 100 ml ūdens ielej 200 ml mērkolbā. Maisa maisītājā 30 minūtes. Pievieno 50 ml trihloretiķskābes šķīduma (2.3.1.), papildina līdz atzīmei ar ūdeni, spēcīgi sakrata un izfiltrē caur kroku filtru.
2.5.2. Ņem tīra filtrāta daudzumu, kāds ir piemērots prognozētajam gaistošo slāpekļa bāzu saturam (parasti der 100 ml). Atšķaida līdz 200 ml, pievieno 2 g magnija oksīda (2.3.2.) un dažus putu dzēšanas emulsijas pilienus (2.3.3.). Izmantojot lakmusa papīru, nosaka šķīduma reakciju. Tai jāuzrāda sārmaina reakcija, pretējā gadījumā vēl pievieno magnija oksīdu (2.3.2.). Aptuveni 150 ml šķīduma destilē Kjeldāla iekārtā un destilātu savāc Erlenmeijera kolbā, kurā ir precīzi nomērīts 0,1 n sērskābes (2.3.4.) daudzums (25 – 50 ml). Destilējot raugās, lai trauka sienas nepārkarstu. Sērskābes šķīdumu vāra divas minūtes, atdzesē un sērskābes pārpalikumu attitrē ar 0,1 n nātrija hidroksīda šķīdumu (2.3.5.) metilsarkanā indikatora (2.3.6.) klātbūtnē.
2.5.3. Veic “tukšo” analīzi, izmantojot to pašu procedūru bez analizējamā parauga.
2.6. Rezultātu aprēķināšana
1 ml 0,1 n H2SO4 atbilst 1,7 mg amonjaka. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
2.7. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10% no amonjaka relatīvās vērtības.
Zemkopības ministrs M.Roze
15.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Kopējā fosfora daudzuma noteikšana ar fotometrisko metodi
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka kopējo fosfora saturu barībā. Metode ir piemērota tādu produktu analīzei, kuros ir zems fosfora daudzums. Dažos gadījumos (ja produktā ir daudz fosfora) var izmantot gravimetrisko metodi.
2. Princips
Paraugu mineralizē, izmantojot sauso dedzināšanu (organiskās barības gadījumā) vai skābes hidrolīzi (kombinēto minerālu un šķidrās barības gadījumā), un veic skābes izvilkumu. Šķīdumu apstrādā ar molibdovanadāta reaģentu. Šādi iegūtā dzeltenā šķīduma optisko blīvumu mēra ar spektrofotometru pie 430 nm.
3. Reaģenti
3.1. Kalcija karbonāts – a.t.;
3.2. Sālsskābe – a.t., d 1,1 (aptuveni 6 n);
3.3. Slāpekļskābe – a.t., d 1,045;
3.4. Slāpekļskābe – a.t., d 1,38 līdz 1,42;
3.5. Sērskābe – a.t., d 1,84;
3.6. Molibdovanadāta reaģents
200 ml amonija heptomolibdāta šķīduma (3.6.1.), 200 ml amonija monovanadāta šķīduma (3.6.2.) un 134 ml slāpekļskābes (3.4.) sajauc 1 litra mērkolbā. Uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei.
3.6.1. Amonija heptomolibdāta šķīdums: karstā ūdenī izšķīdina 100 g amonija heptomolibdāta (NH4) 6Mo7024 4 H2O. Pievieno 10 ml amonjaka (d: 0,91) un uzpilda ar ūdeni līdz 1 litram
3.6.2. Amonija monovanadāta šķīdums: 400 ml karsta ūdens izšķīdina 2,35 g amonija monovanadāta (t.a) NH4VO3. Pastāvīgi maisot, lēnām pievieno 20 ml atšķaidītas slāpekļskābes (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) un papildina līdz 1 litram ar ūdeni;
3.7. 1 mg/ ml fosfora standarta šķīdums: ūdenī izšķīdina 4,387 g kālija dihidrogēna fosfāta (a.t.) KH2PO4. Uzpilda ar ūdeni līdz 1 litram.
4. Iekārtas
4.1. Kvarca vai porcelāna tīģeļi;
4.2. Elektriskā mufeļkrāsns – 550°C;
4.3. 250 ml Kjeldāla kolba;
4.4. Mērkolbas un graduētas pipetes;
4.5. Spektrofotometrs;
4.6. Mēģenes vai kolbas ar 16 mm diametru un aizbāžņiem 14,5 mm diametrā, ar 25 līdz 30 ml tilpumu.
5. Darba gaita
5.1. Šķīduma sagatavošana:
Atkarībā no parauga sastāva sagatavo šķīdumu, kā norādīts 5.1.1. vai 5.1.2. apakšpunktā
5.1.1. 1g parauga vai vairāk nosver ar precizitāti līdz 1mg. Analizējamo paraugu ieliek Kjeldāla kolbā, pievieno 20 ml sērskābes (3.5.), sakrata, lai vielu pilnībā piesūcinātu ar skābi un neļautu tai pielipt pie kolbas sienām, uzkarsē un uztur viršanas temperatūru 10 minūtes. Nedaudz atdzesē, pievieno 2 ml slāpekļskābes (3.4.), lēnām uzkarsē, nedaudz atdzesē, pievieno vēl nedaudz slāpekļskābes (3.4.) un atjauno viršanas temperatūru. Procedūru atkārto, kamēr iegūst bezkrāsainu šķīdumu. Atdzesē, pievieno mazliet ūdens, šķīdumu pārnes uz 500 ml mērkolbu, izskalojot Kjeldāla kolbu ar karstu ūdeni. Atdzesē, uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē;
5.1.2. Paraugi, kas satur organiskās vielas un kuros nav kalcija un magnija dihidrogēnfosfātu. Pārpelnošanas tīģelī iesver aptuveni 2,5g parauga ar precizitāti līdz 1mg. Analizējamo paraugu sajauc ar 1g kalcija karbonāta (3.1.). Karsē krāsnī pie 550°C ± 5°C, kamēr iegūst baltus vai pelēkus pelnus (nelielam oglekļa daudzumam nav nozīmes). Pelnus pārnes uz 250 ml vārglāzi. Pievieno 20 ml ūdens un sālsskābi (3.2.), kamēr beidzas putošana. Pievieno vēl 10 ml sālsskābes (3.2.). Vārglāzi tvaicē smilšu vanniņā, kamēr sausa, lai padarītu silīcija dioksīdu nešķīstošu. Atlikumu atkārtoti šķīdina 10 ml slāpekļskābes (3.3.) un 5 minūtes vāra smilšu vanniņā, netvaicējot sausu. Šķidrumu pārnes uz 500 ml mērkolbu, izskalojot vārglāzi vairākas reizes ar karstu ūdeni. Atdzesē, uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē.
5.2. Optiskā blīvuma mērīšana
Saskaņā ar 5.1.1. vai 5.1.2. apakšpunkta aprakstu iegūto filtrātu atšķaida, lai dabūtu fosfora koncentrāciju, kas nepārsniedz 40 μg/ml. 10 ml iegūtā šķīduma ielej mēģenē vai kolbā (4.6.) un pievieno 10 ml molibdovanadāta reaģenta (3.6.). Samaisa un atstāj 20°C temperatūrā vismaz 10 minūtes. Spektrofotometrā pie 430nm izmēra optisko blīvumu pret šķīdumu, ko iegūst, pievienojot 10 ml molibdovanadāta reaģenta (3.6.) un 10 ml ūdens.
5.3. Kalibrācijas līkne
5.3.1. No standarta šķīduma (3.7.) sagatavo šķīdumus, kas satur attiecīgi 5, 10, 20, 30 un 40μg fosfora/1 ml. Ņem 10 ml katra šķīduma un pievieno 10 ml molibdovanadāta reaģenta (3.6.). Samaisa un atstāj 20°C temperatūrā vismaz 10 minūtes. Optisko blīvumu izmēra tā, kā aprakstīts 5.2. apakšpunktā.
5.3.2. Veido kalibrācijas līkni, atzīmējot optisko blīvumu un tam atbilstošo fosfora daudzumu. Ja fosfora koncentrācija ir robežās no 0 līdz 40μg/ml, līkne būs lineāra.
6. Rezultātu aprēķināšana
Nosaka fosfora daudzumu analizējamajā paraugā, izmantojot kalibrācijas līkni. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
7. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
7.1. 3 % no relatīvā lieluma, ja fosfora saturs ir mazāks par 5%
7.2. 0,15 % no absolūtā lieluma, ja fosfora saturs ir 5% vai lielāks.
Zemkopības ministrs M.Roze
16.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Koptauku un eļļu noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
1.1. Ar šo metodi nosaka koptauku un eļļu saturu barībā. Eiropas Padomes Regulā Nr. 136/66/EEK definēto eļļas sēklu un eļļas augļu analīzes neveic ar šo metodi.
1.2. Atkarībā no barība rakstura un sastāva var izmantot vienu no metodēm:
1.2.1. A metode (ekstrahēšana ar dietilēteri): piemēro visiem augu valsts barības veidiem, izņemot tos, kas minēti 1.2.2.apakšpunktā;
1.2.2. B metode: piemēro dzīvnieku valsts izcelsmes barībai un visiem kombinētās barības līdzekļiem. Tā ir jāizmanto barības līdzekļiem, no kuriem eļļas un taukus nevar pilnībā ekstrahēt bez iepriekšējas hidrolīzes (glutēniem, raugam, kartupeļu proteīnam un produktiem, kas ir pakļauti tādiem procesiem kā ekstrūzija, placināšana, žāvēšana un sildīšana).
1.3. Rezultātu skaidrošana – visos gadījumos, kad, izmantojot B metodi, tiek iegūts lielāks rezultāts nekā izmantojot A metodi, B metodes rādītājs ir uzskatāms par pareizu.
2. Princips
2.1. A metode:
Paraugu ekstrahē ar dietlēteri, frakcija 40 – 60. Pēc šķīdinātāja atdestilēšanas atlikumu izžāvē un nosver.
2.2. B metode:
Karsējot, paraugu apstrādā ar sālsskābi. Šķīdumu atdzesē un filtrē. Atlikumu mazgā un žāvē, veic mērījumus saskaņā ar A metodi.
3. Reaģenti
3.1. Dietilēteris – 40 – 60°C. Broma vērtībai ir jābūt mazākai par 1 un pārpalikumam pēc iztvaicēšanas mazākam par 2 mg/100 ml;
3.2. Bezūdens nātrija sulfāts;
3.3. Sālsskābe – c=3 mol HCl/l;
3.4. Filtrēšanas materiāls (piemēram, kizelgurs vai Hyflo–supercel).
4. Iekārtas
4.1. Ekstraktori – ja tie ir aprīkoti ar sifonu (Soksleta iekārta), šķīdinātāja caurplūdei stundas laikā jāveic 10 cikli, vai ja nav aprīkoti ar sifonu, tad šķīdinātāja caurplūdei ir jābūt 10 ml/min.;
4.2. Ekstrakcijas trauki – dietilēterī nešķīstoši materiāli ar porainību, kas atbilst 4.1. punktā minētajām prasībām;
4.3. Vakuuma žāvēšanas krāsns, kas noregulēta uz 75°C ± 3°C vai krāsns žāvēšanai ar gaisu, kas noregulēta uz 100°C ± 3°C.
5. Darba gaita
5.1. A metode: skatīt 8.1.apakšpunktu
5.1.1. Nosver 5 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg, ievieto ekstrakcijas traukā (4.2.) un pārklāj ar attaukotu vates gabalu.
5.1.2. Trauku ievieto ekstraktorā (4.1.) un sešas stundas ekstrahē ar ēteri (3.1.). Ētera ekstraktu savāc sausā nosvērtā kolbā, kurā ir pumeka gabaliņi (1).
5.1.3. Šķīdumu atdestilē un tvaicēšanas atlikumu pusotru stundu žāvē krāsnī (4.3.). To atdzesē eksikatorā un nosver. Žāvē vēl 30 minūtes, lai pārliecinātos, ka eļļas un tauku svars nemainās (svara zudumi divās secīgās svēršanās nedrīkst pārsniegt 1 mg).
5.2. B metode
5.2.1.Nosver 2,5 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg (skatīt 8.2. apakšpunktu) un pārnes uz 400 ml vārglāzi vai 300 ml Erlenmeijera kolbu. Pievieno 100 ml sālsskābes (3.3.) un pumeka gabaliņus. Vārglāzi nosedz ar pulksteņstiklu vai Erlenmeijera kolbu aprīko ar atteces dzesinātāju. Maisījumu uz mazas liesmas vai karstas virsmas lēnām uzvāra un tur vienu stundu. Neļauj produktam pielipt pie trauka sienām.
5.2.2. Atdzesē un pievieno pietiekamu daudzumu filtrējošā materiāla (3.4.), lai novērstu eļļas un tauku zudumu filtrēšanas laikā. Filtrē caur mitru beztauku dubulto filtrpapīru. Atlikumu mazgā ar aukstu ūdeni līdz ir sasniegts neitrāls filtrāts. Pārbauda, vai filtrātā nav eļļa vai tauki. To esamība norāda, ka paraugs pirms hidrolīzes ir jāekstrahē ar ēteri, izmantojot A metodi.
5.2.3. Dubulto filtrpapīru ar atlikumu novieto uz pulksteņstikla un pusotru stundu žāvē žāvējamā krāsnī 100°C ± 3°C temperatūrā.
5.2.4. Ievieto dubulto filtrpapīru un sauso atlikumu ekstraktora traukā (4.2.) un pārklāj ar attaukotu vates gabalu. Novieto to ekstraktorā (4.1.) un rīkojas tā, kā norādīts 5.1. 2. un 5.1.3.apakšpunktā.
5.2.5. Ja ar eļļām un taukiem ir jāveic vēl kādas analīzes, tad pumeka gabaliņus aizstāj ar stikla gabaliņiem.
6. Rezultātu aprēķināšana
Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
7. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
7.1. 0,2 % absolūtās vērtības, ja kopējo eļļu un tauku saturs zemāks par 5 – 4,0 % ,
7.2. 0,4% absolūtās vērtības, ja kopējo eļļu un tauku saturs ir lielāks par 10%.
8. Piezīmes
Produkus ar augstu eļļas un tauku saturu vai kurus ir grūti sasmalcināt, vai arī no kuriem nevar sagatavot viendabīgu analizējamo paraugu, sagatavo šādi:
8.1. nosver 20 g parauga ar precizitāti līdz 1mg un to sajauc ar 10 g vai vairāk bezūdens nātrija sulfāta (3.2.). Ekstrahē ar ēteri (3.1.) tā, kā aprakstīts 5.1. apakšpunktā. Iegūto ekstraktu ar ēteri papildina līdz 500 ml un samaisa. 50 ml šķīduma pārnes uz nelielu, sausu, nosvērtu kolbu, kurā ir pumeka gabaliņi (1). Šķīdinātāju atdala destilējot. Atlikumu žāvē un rīkojas tā, kā aprakstīts 5.1. apakšpunkta pēdējā rindkopā.
8.2. atdala šķīdinātāju no ekstrakcijas traukā palikušā atlikuma un atlikumu sasmalcina līdz 1 mm lielām daļiņām. To ievieto atpakaļ ekstrakcijas traukā (nātrija sulfātu nepievieno) un rīkojas tā, kā aprakstīts 5.1. apakšpunkta otrajā un trešajā rindkopā.
8.3. Rezultātus aprēķina kā procentus no parauga, izmantojot šādu formulu:
(10 a + b) x 5,
kur
a = atlikuma masa gramos pēc pirmās ekstrakcijas (ekstrakta daļa, kas ņemta analīzei)
b = atlikuma masa gramos pēc otrās ekstrakcijas
8.4. Produktiem ar zemu eļļu un tauku saturu analizējamo paraugu var palielināt līdz 5 g.
8.5. Mājdzīvnieku barība, kurā ir augsts ūdens saturs, pirms hidrolīzes un ekstrakcijas ir jāsajauc ar bezūdens nātrija sulfātu saskaņā ar B metodi.
8.6. 5.2. apakšpunktā filtrēšanas atlikuma mazgāšanai auksta ūdens vietā daudz efektīvāk ir izmantot karstu ūdeni.
8.7. Atsevišķām barībām pusotru stundu ilgo parauga žāvēšanas laiku var pagarināt. Tomēr ir jāizvairās no pārāk ilgas žāvēšanas, jo tās rezultātā var iegūt zemus analīžu rezultātus. Var izmantot mikroviļņu krāsni.
8.8. Ja kopējais eļļas un tauku saturs paraugā ir lielāks par 15%, ir ieteicams A metodē pirms hidrolīzes veikt sākotnējo ekstrahēšanu un B metodē veikt atkārtoto ekstrahēšanu. Tas ir atkarīgs no barības līdzekļa sastāva un no eļļas un tauku rakstura barībā.
1 Ja ar eļļām un taukiem ir jāveic vēl kādas analīzes, aizstājiet pumeka gabaliņus ar stikla gabaliņiem.
Zemkopības ministrs M.Roze
17.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Kopproteīna noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka kopproteīna saturu barībā, pamatojoties uz slāpekļa saturu, kuru savukārt nosaka ar Kjeldāla metodi.
2. Princips
Paraugu mineralizē ar sērskābi katalizatora klātbūtnē. Skābo šķīdumu pasārmina ar nātrija hidroksīda šķīdumu. Destilējot atdala amonjaku un savāc izmērītā sērskābes daudzumā, kuras pārākumu attitrē ar nātrija hidroksīda standartšķīdumu.
3. Reaģenti
3.1. Kālija sulfāts
3.2. Katalizators: vara (II) oksīds CuO vai vara (II) sulfāta pentahidrāts CuSO4·5H2O
3.3. Cinka granulas
3.4. Sērskābe – d = 1,84 g/ml
3.5. Sērskābe – c (H2SO4) = 0,5 mol/l
3.6. Sērskābe – c (H2SO4) = 0,1 mol/l
3.7. Metilsarkanais indicators – 300 mg metilsarkanā izšķīdina 100 ml 95 līdz 96% (V/V) etilspirtā
3.8. Nātrija hidroksīda 40% (m/V) šķīdums (var lietot tehniskas kvalitātes)
3.9. Nātrija hidroksīda šķīdums – c (NaOH) = 0,25 mol/l
3.10. Nātrija hidroksīda šķīdums – c (NaOH) = 0,1 mol/l
3.11. Granulēts pumeks – mazgāts sālsskābē un izdedzināts
3.12. Acetanilīds (k.t. = 1140C, N = 10,36 %)
3.13. Saharoze, kas nesatur slāpekli
4. Aparatūra
Aparāts mineralizācijai, destilācijai un titrēšanai pēc Kjeldāla metodes.
5. Darba gaita
5.1. Mineralizācija
Nosver 2 g parauga ar precizitāti līdz 0,001 mg un ievieto mineralizācijas aparāta kolbā. Pievieno 15 g kālija sulfāta (3.1.) un atbilstīgu katalizatora (3.2.) daudzumu (0,3 līdz 0,4 g vara (II) oksīda vai 0,9 līdz 1,2 g vara sulfāta, 25 ml sērskābes (3.4.) un dažas pumeka (3.11.) granulas, samaisa. Kolbu sākumā silda lēni, šad tad pakratot, līdz masa ir pārogļojusies un pazudušas putas. Pēc tam silda straujāk, līdz šķidrums nepārtraukti vārās. Karsēšana ir adekvāta, ja virstošā skābe kondensējas uz kolbas sienām. Jāizvairās pārāk stipri sakarsēt kolbas sānus, lai tiem nepieliptu organisko vielu daļiņas. Kad šķidrums kļūst dzidrs un gaiši zaļš, turpina vārīt vēl divas stundas, pēc tam atstāj atdzist.
5.2. Destilācija
5.2.1. uzmanīgi pievieno pietiekamu daudzumu ūdens, lai sulfāti pilnīgi izšķīstu. Atstāj atdzist. Pievieno dažas cinka granulas (3.3.).
5.2.2. destilācijas aparāta uztvērējkolbā ielej precīzi nomērītu daudzumu – 25 ml sērskābes (3.5.) vai (3.6.) atkarībā no paredzamā slāpekļa satura un pievieno dažus pilienus metilsarkanā indikatora šķīduma (3.7.).
5.2.3. pievieno mineralizācijas kolbu destilācijas aparāta dzesinātājam un iegremdē dzesinātāja galu uztvērējkolbā esošajā šķidrumā vismaz 1 cm dziļumā (skatīt piezīmi 8.3.apakšpunktā). Bez amonjaka zudumiem mineralizācijas kolbā lēni ielej 100 ml 40 % nātrija hidroksīda šķīduma (3.8.).
5.2.4. kolbu silda, līdz viss amonjaks ir pārdestilēts.
5.3. Attitrēšana
Uztvērējkolbā sērskābes pārākumu attitrē ar nātrija hidroksīda šķīdumu (3.9.) vai (3.10.) atkarībā no izmantotās sērskābes koncentrācijas – līdz ekvivalences punktam.
5.4. Tukšais mēģinājums
Lai noteiktu, vai reaģenti nesatur slāpekli, izdara tukšo mēģinājumu (mineralizāciju, destilēšanu un titrēšanu) parauga vietā ņemot 1 g slāpekli nesaturošas saharozes (3.13.).
6. Rezultātu aprēķināšana
Kopproteīna saturu paraugā aprēķina pēc formulas:
(V1 – V0) ·
c · 0,014 · 100 · 6,25
–––––––––––––––––––––––––,
m
kur
V0 – NaOH šķīduma (3.9. vai 3.10.) tilpums, kas izlietots tukšā mēģinājuma titrēšanai ml
V1 – NaOH šķīduma (3.9. vai 3.10.) tilpums, kas izlietots analizējamā parauga titrēšanai ml
c – NaOH šķīduma (3.9. vai 3.10.) koncentrācija mol/l
m – analizējamā parauga masa g
7. Metodes pārbaude
7.1. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
7.1.1. 0,2 pēc absolūtā lieluma kopproteīna saturam, kurš mazāks par 20%
7.1.2. 1,0 % pēc relatīvā lieluma kopproteīna saturam, kurš nav mazāks par 20% un lielāks par 40%
7.1.3. 0,4 pēc absolūtā lieluma kopproteīna saturam, kurš lielāks par 40 %
7.2. Precizitāte
Veic analīzi (mineralizāciju, destilēšanu un titrēšanu) ar 1,5 – 2,0 g acetanilīda (3.12.) 1 g saharozes (3.13.) klātbūtnē. 1 g acetanilīda patērē 14,80 ml sērskābes (3.5.). Atgūstamībai jābūt vismz 99 %.
8. Piezīmes
8.1. Var izmantot manuālos, pusautomātiskos vai automātiskos aparātus. Ja izmanto aparātus, kuros ir vajadzīga pārliešana starp mineralizāciju un destilāciju, pārliešana jāizdara uzmanīgi, bez zudumiem. Ja destilācijas aparāta kolba nav aprīkota ar pilināmo piltuvi, nātrija hidroksīdu pievieno tieši pirms kolbas savienošanas ar dzesinātāju, ielejot šķidrumu lēni gar sieniņām.
8.2. Ja mineralizācijas maisījums sacietē, noteikšanai ieteicams izmantot lielāku sērskābes (3.6.) tilpumu nekā teikts iepriekš tekstā.
8.3. Produktiem ar zemu slāpekļa saturu uztvērēj kolbā ievietojamo sērskābes šķīduma (3.6.) daudzumu vajadzības gadījumā var samazināt līdz 10 ml vai 15 ml un uzpildīt līdz 25 ml ar ūdeni.
Zemkopības ministrs M.Roze
18.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Ar pepsīnu un sālsskābi izšķīdinātā kopproteīna noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka kopproteīna daļu, kas noteiktos apstākļos izšķīdināta ar pepsīnu un sālsskābi. Tā ir piemērojama visu veidu barībai.
2. Princips
Paraugu 48 stundas silda pie 40oC pepsīna hidrohlorīda šķīdumā. Suspensiju izfiltrē un slāpekļa saturu filtrātā nosaka saskaņā ar kopproteīna noteikšanas metodi.
3. Reaģenti
3.1. Sālsskābe – d = 1,125
3.2. Sālsskābe 0,075 N
3.3. 2,0 vien. /mg pepsīns. Pepsīna aktivitāte ir definēta pepsīna aktivitātes noteikšanas metodē un to nosaka saskaņā ar minēto metodi.
3.4. Aptuveni 0,2 % (m/V) svaigi pagatavota pepsīna šķīduma sālsskābē (3.2.). Aktivitāte: 400 vien. /l
3.5. Pretputošanas emulsija (piemēram, silikona emulsija)
3.6. Visi reaģenti, kas uzskaitīti kopproteīna noteikšanas metodes 3. punktā
4. Aparatūra
4.1. Ūdens vanna vai inkubators – noregulēts pie 40 ± 1 oC
4.2. Kjeldāla mineralizācijas un destilācijas aparāts
5. Darba gaita
5.1. Šķīduma sagatavošana (sk. 7.2. piezīmi).
Nosver 2 g parauga ar precizitāti līdz tuvākajam mg un ievieto 500 ml mērkolbā. Pievieno 450 ml pepsīna hidrohlorīda šķīduma (3.4.), kas iepriekš uzsildīts līdz 40oC, un krata, lai novērstu aglomerātu veidošanos. Pārliecinās, ka suspensijas pH ir mazāks par 1,7. Ieliek kolbu ūdens vannā vai inkubatorā (4.1.) un atstāj uz 48 stundām. Sakrata pēc 8, 24 un 32 stundām. Pēc 48 stundām pievieno 15 ml sālsskābes (3.1.), atdzesē līdz 20oC, uzpilda līdz atzīmei ar ūdeni un izfiltrē.
5.2. Mineralizācija
5.2.1. 250 ml filtrāta ielej destilācijas aparāta kolbā (4.2.). Pievieno šķelšanai vajadzīgos reaģentus, kas norādīti kopproteīna noteikšanas metodes 5.1. punkta otrajā teikumā. Homogenizē un uzkarsē līdz viršanai. Ja veidojas putas, pievieno dažus pilienus pretputošanas emulsijas (3.5.). Turpina enerģiski vārīt, līdz ūdens ir gandrīz pilnīgi iztvaicēts. Samazina sildīšanu un uzmanīgi aizvada pēdējās ūdens pēdas.
5.2.2. Kad šķidrums kļūst dzidrs un bezkrāsains (vai gaiši zaļš, ja ir lietots varu saturošs katalizators), turpina vārīt vēl vienu stundu. Atstāj atdzist.
5.3. Destilēšana un titrēšana
Rīkojas tā, kā aprakstīts kopproteīna noteikšanas metodes 5.2. un 5.3. apakšpunktā.
5.4. Tukšais mēģinājums
Izdara tukšo mēģinājumu, izmantojot to pašu darba gaitu, bet bez analizējamā parauga.
6. Rezultātu aprēķināšana
6.1. Atņem tukšajā mēģinājumā patērētās sērskābes daudzumu no analizējamā parauga patērētā sērskābes daudzuma. 1 ml 0,1 N sērskābes atbilst 1,4 mg slāpekļa.
6.2. Slāpekļa daudzumu reizina ar koeficientu 6,25. Rezultātu izsaka kā procentus no parauga svara.
7. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
7.1. 0,4 pēc absolūtā lieluma kopproteīna saturam, kurš mazāks par 20 %
7.2. 2,0 % relatīvo lielumu kopproteīna saturam, kurš nav mazāks par 20 % un nav lielāks par 40 %
7.3. 0,8 pēc absolūtā lieluma kopproteīna saturam, kurš lielāks par 40 %
8. Piezīmes
8.1. Ar šo metodi iegūtajiem lielumiem nav tiešas saistības ar šķelšanu in vivo.
8.2. Produkti ar eļļas vai tauku saturu, kas pārsniedz 10 %, vispirms ir jāatbrīvo no taukiem, ekstrahējot ar petrolēteri (v.p. 40 līdz 60oC).
Zemkopības ministrs M.Roze
19.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Pepsīna aktivitātes noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka aktivitāti pepsīnam, ko izmanto ar pepsīnu un sālsskābi izšķīdināta kopproteīna noteikšanai.
2. Princips
2.1. hemoglobīnu apstrādā ar pepsīnu sālsskābes vidē noteiktos apstākļos. Pēc tam proteīnu nehidrolizēto daļu izgulsnē trihloretiķskābē. Filtrātam pievieno nātrija hidroksīdu un Folina–Čikalteu (Folin–Ciocalteu) reaģentu. Pie 750 nm izmēra šā šķīduma optisko blīvumu un atbilstīgo tirozīna daudzumu nolasa no kalibrācijas līknes.
2.2. definīcija: pepsīna vienību definē kā šā fermenta daudzumu, kas metodes pielietošanas apstākļos minūtē atbrīvo hidroksiarilgrupu daudzumu, kuram, iekrāsotam ar Folina–Čikalteu reaģentu, ir optiskais blīvums, kas atbilst vienam mikromolam tirozīna, kurš iekrāsots tādā pašā veidā.
3. Reaģenti
3.1. Sālsskābe 0,2 N
3.2. Sālsskābe 0,06 N
3.3. Sālsskābe 0,025 N
3.4. Trihloretiķskābes 5 % (masa/tilpums) šķīdums
3.5. Nātrija hidroksīda 0,5 N šķīdums
3.6. Folina–Čikalteu reaģents – ievieto 2 litru apaļkolbā ar pieslīpēta stikla standartkaklu 100 g nātrija volframāta (Na2WO4,·2H2O), 25 g nātrija molibdāta (Na2MoO4, 2H2O) un 700 ml ūdens. Pievieno 50 ml fosforskābes (d = 1,71) un 100 ml koncentrētas sālsskābes (d = 1.19). Pievieno kolbai atteces dzesinātāju, uzkarsē līdz viršanai un šķīdumu lēni vāra 10 stundas. Atstāj atdzist, atvieno atteces dzesinātāju, pievieno 175 g litija sulfāta (Li2SO4, ·2H2O), 50 ml ūdens un 1 ml broma. Vāra 15 minūtes, lai aizvadītu pārpalikušo bromu.
Atstāj atdzist, pārnes šķīdumu uz 1 l mērkolbu, uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei, homogenizē un filtrē. Nedrīkst rasties zaļgans krāsojums. Atšķaida vienu tilpumu reaģenta ar diviem tilpumiem ūdens pirms lietošanas.
3.7. Hemoglobīna šķīdums
Nosver hemoglobīna daudzumu (aptuveni 2 g proteīnu substrāta, kas noteikts saskaņā ar Ansona metodi) un atbilst 354 mg slāpekļa1, un ievieto 200 ml kolbā ar šlifa standartkaklu. Pievieno dažus ml sālsskābes (3.2.), savieno kolbu ar vakuumsūkni un krata, līdz hemoglobīns ir pilnīgi izšķīdis. Atvieno vakuumu un kratot pievieno sālsskābi (3.2.), lai uzpildītu līdz 100 ml. Sagatavo tieši pirms lietošanas.
3.8. Standarta tirozīna šķīdums – izšķīdina sālsskābē (3.1.) 181,2 mg tirozīna un uzpilda līdz 1 l ar to pašu skābi (izejas šķīdums). Ņem 20 ml un atšķaida ar sālsskābi (3.1.) līdz 100 ml. Šā šķīduma 1 ml satur 0,2 mikromolus tirozīna.
4. Aparatūra
4.1. Ūdens vanna – noregulēta uz 25 ± 0,1 oC ar ultratermostatu
4.2. Spektrofotometrs
4.3. Hronometrs ar precizitāti 1 sekunde
4.4. pH metrs
5. Darba gaita
5.1. Šķīduma sagatavošana (skatīt piezīmi 7.1.apakšpunktā)
Izšķīdina 150 mg pepsīna 100 ml sālsskābes (3.2.). Ar pipeti pārnes 2 ml šķīduma uz 50 ml mērkolbu un uzpilda līdz atzīmei ar sālsskābi (3.3.). Ar pH metru izmērītajam šķīduma pH jābūt 1,6 ± 0,1. Kolbu iegremdē ūdens vannā (4.1.).
5.2. Hidrolīze
Mēģenē ar pipeti pārnes 5,0 ml hemoglobīna šķīduma (3.7.), uzsilda ūdens vannā (4.1.) līdz 25 oC, pievieno 1,0 ml pepsīna šķīduma, kas iegūts atbilstīgi 5.1.apakšpunktam, un samaisa ar vienā galā paresninātu stikla spieķīti (apmēram ar 10 kustībām uz priekšu un atpakaļ). Atstāj mēģeni ūdens vannā pie 25oC precīzi 10 minūtes, skaitot no pepsīna šķīduma pievienošanas (ilgums un temperatūra ir stingri jāievēro). Pēc tam pievieno 10,0 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.4.), kas iepriekš uzsildīts līdz 25oC, homogenizē un nofiltrē caur sausu filtru.
5.3. Krāsojuma attīstīšana un optiskā blīvuma mērīšana
50 ml koniskajā kolbā ar pipeti pārnes 5,0 ml filtrāta, pievieno 10,0 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.5.) un, visu laiku kratot, pievieno 3,0 ml atšķaidīta Folina–Čikalteu reaģenta (3.6.). Pēc 5 līdz 10 minūtēm ar spektrofotometru pie 750 nm nosaka šķīduma optisko blīvumu 1 cm kivetē pret ūdeni.
5.4. Tukšais mēģinājums
Katrai noteikšanai izdara tukšo mēģinājumu šādi – mēģenē ar pipeti pārnes 5,0 ml hemoglobīna šķīduma (3.7.), uzsilda ūdens vannā (4.1.) līdz 25oC, pievieno 10,0 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.4.), kas iepriekš sasildīts līdz 25 oC, homogenizē, pēc tam pievieno 1,0 ml pepsīna šķīduma, kas iegūts saskaņā ar 5.1.apakšpunktu. Ar stikla spieķīti samaisa un atstāj mēģeni ūdens vannā (4.1.) 250C temperatūrā precīzi 10 minūtes. Homogenizē un filtrē caur sausu filtru. Rīkojas, kā norādīts 5.3.apakšpunktā.
5.5. Kalibrēšanas līkne
Ievieto 50 ml koniskajās kolbās 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 un 5,0 ml alikvotās daļas tirozīna šķīduma (3.8.), kas attiecīgi atbilst 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 un 1,0 mikromolam tirozīna. Sēriju beidz ar salīdzināšanas šķīdumu, kurā nav tirozīna. Tilpumus uzpilda līdz 5,0 ml ar sālsskābi (3.1.). Pievieno 10,0 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.5.) un, visu laiku kratot, pievieno 3,0 ml atšķaidīta Folina–Čikalteu reaģenta (3.6.). Izmēra optisko blīvumu, kā norādīts 5.3.apakšpunkta pēdējā teikumā. Uzzīmē kalibrācijas līkni, atzīmējot optiskos blīvumus pret tirozīna daudzumiem.
6. Rezultātu aprēķināšana
6.1. no kalibrēšanas līknes nolasa tirozīna daudzumu mikromolos, kas atbilst krāsainā šķīduma optiskajam blīvumam, koriģētam pret tukšo mēģinājumu.
6.2. pepsīna aktivitāti tirozīna mikromolos uz mg minūtē pie 25oC aprēķina, izmantojot šādu formulu:
vienības uz mg (vien./mg) = ,
0,32a
___________
p
kur
a – tirozīna daudzums mikromolos, nolasīts no kalibrēšanas līknes
p – pepsīna daudzums miligramos, kas pievienots saskaņā ar 5.2. punktu
7. Piezīmes
7.1. Izšķīdināmā pepsīna daudzumam jābūt tādam, lai galīgajos fotometrijas mērījumos iegūtu optisko blīvumu 0,35 ± 0,035
7.2. Ar šo metodi iegūtas divas vienības uz mg atbilst 3,64 Ansona milivienībām uz mg (mikromoli tirozīna/mg. min. pie 35,5oC) vai 36 400 komercvienības/g (mikromoli tirozīna/g 10 minūtēs pie 35,5oC)
1 Nosaka slāpekļa saturu ar pusmikro Kjeldāla metodi (teorētiskais slāpekļa saturs – 17,7 %).
Zemkopības ministrs M.Roze
20.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Brīvā un kopējā gosipola noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka brīvo gosipolu, kopējo gosipolu un ķīmiski radniecīgu vielu līmeņus kokvilnas sēklās, kokvilnas sēklu miltos un kokvilnas sēklu raušos, kā arī kombinētajā barībā, kas satur šīs vielas, ja to ir vairāk par 20ppm.
2. Princips
Gosipolu ekstrahē 3–amino–1–propanola klātbūtnē ar 2–propanola un heksāna maisījumu brīvā gosipola noteikšanai vai ar dimetilformamīdu kopējā gosipola noteikšanai. Gosipolu ar anilīnu pārvērš gosipoldianilīnā, kura optisko blīvumu mēra pie 440 nm.
3. Reaģenti
3.1. 2–propanola–heksāna maisījums. Samaisa 60 tilpuma daļas analītiski kvalitatīva 2–propanola ar 40 tilpuma daļām heksāna
3.2. Šķīdinātājs A: 1 litra mērkolbā ielej aptuveni 500 ml 2–propanola–heksāna maisījuma (3.1.), 2 ml 3–amino–1–propanola, 8 ml ledus etiķskābes un 50 ml ūdens. Uzpilda līdz zīmei ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.). Šis reaģents ir stabils vienu nedēļu
3.3. Šķīdinātājs B: ar pipeti pārnes 2 ml 3–amino–1–propanola un 10 ml ledus etiķskābes 100 ml mērkolbā. Atdzesē līdz istabas temperatūrai un uzpilda līdz zīmei ar N,N–dimetilformamīdu. Šis reaģents ir stabils vienu nedēļu
3.4. Anilīns, analīzes kvalitātes. Ja tukšajā mēģinājumā optiskais blīvums ir lielāks par 0,022, anilīnu pārdestilē virs cinka putekļiem, izmetot destilāta pirmos un pēdējos 10 % frakciju. Turot ledusskapī brūnā, noslēgtā traukā, šis reaģents ir glabājams vairākus mēnešus
3.5. Gosipola standartšķīdums A: Ievieto 250 ml mērkolbā 27,9mg gosipola acetāta. Izšķīdina un uzpilda līdz zīmei ar šķīdinātāju A (3.2.). Ar pipeti pārnes 50 ml šā šķīduma 250 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar šķīdinātāju A. Šā gosipola šķīduma koncentrācija ir 0,02mg mililitrā. Pirms lietošanas atstāj uz vienu stundu istabas temperatūrā
3.6. Gosipola standartšķīdums B: Ievieto 50 mērkolbā 27,9mg gosipola acetāta. Izšķīdina un uzpilda līdz zīmei ar šķīdinātāju B (3.3.). Šā gosipola šķīduma koncentrācija ir 0,5mg mililitrā
Gosipola standartšķīdumi A un B ir stabili 24 stundas, ja tos aizsargā no gaismas.
4. Aparatūra
4.1. Maisītājs: Aptuveni 35apgr./min.
4.2. Spektrofotometrs
5. Darba gaita
5.1. Analizējamais paraugs
Analizējamā parauga lielums ir atkarīgs no gaidāmā gosipola satura paraugā. Ir ieteicams strādāt ar mazu analizējamo paraugu un relatīvi lielu filtrāta alikvoto daļu, lai ar iegūto gosipola daudzumu būtu iespējami precīzi fotometrijas mērījumi. Brīva gosipola noteikšanai kokvilnas sēklās, kokvilnas sēklu miltos un kokvilnas sēklu raušos analizējamam paraugam nebūtu jāpārsniedz 1g. Kombinētās barības paraugs var būt līdz 5g. Vairumā gadījumu piemērota ir 10 ml filtrāta alikvotā daļa. Tai būtu jāsatur 50 līdz 100µg gosipola. Kopējā gosipola noteikšanai analizējamam paraugam jābūt starp 0,5g un 5g tā, lai 2 ml filtrāta alikvotā daļa saturētu 40µg līdz 200µg gosipola. Analīze jāizdara istabas temperatūrā – aptuveni 20°C.
5.2. Brīvā gosipola noteikšana.
5.2.1. analizējamo paraugu ievieto 250 ml kolbā ar pieslīpētu kaklu, kuras dibens ir klāts ar stikla lauskām. Ar pipeti pievieno 50 ml šķīdinātāja A (3.2.), aiztaisa kolbu un maisa maisītājā vienu stundu. Nofiltrē caur sausu filtru un savāc filtrātu mazā kolbā ar pieslīpētu kaklu. Filtrēšanas laikā piltuvi apklāj ar pulksteņstiklu. Ar pipeti pārnes identiskas filtrāta alikvotās daļas, kas satur 50µg līdz 100µg gosipola, katrā no divām 25 ml mērkolbām (A un B). Vajadzības gadījumā tilpumu uzpilda līdz 10 ml ar šķīdinātāju A (3.2.). Pēc tam A kolbas saturu uzpilda līdz zīmei ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.). Šo šķīdumu izmanto kā salīdzināšanas šķīdumu, pret kuru mēra parauga šķīdumu.
5.2.2. ar pipeti pārnes 10 ml šķīdinātāja A (3.2.) katrā no divām citām 25 ml mērkolbām (C un D). C kolbas saturu uzpilda līdz zīmei ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.). Šo šķīdumu izmanto kā salīdzināšanas šķīdumu, pret kuru mēra tukšā mēģinājuma šķīdumu.
5.2.3. pievieno 2 ml anilīna (3.4.) katrā no kolbām (D) un (B). Silda 30 minūtes vāroša ūdens vannā, lai attīstītu krāsu. Atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz zīmei ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.), homogenizē un atstāj nostāvēties vienu stundu.
5.2.4. ar spektrofotometru pie 440 nm nosaka optisko blīvumu tukšā mēģinājuma šķīdumam (D) pret salīdzināšanas šķīdumu (C) un optisko blīvumu parauga šķīdumam (B) pret salīdzināšanas šķīdumu (A), izmantojot 1 cm stikla kivetes.
5.2.5. atņem tukšā mēģinājuma šķīduma optisko blīvumu no parauga šķīduma optiskā blīvuma (= koriģētais optiskais blīvums). No šā lieluma aprēķina brīvā gosipola saturu, kā norādīts 6. punktā.
5.3. Kopējā gosipola noteikšana.
5.3.1. analizējamo paraugu, kas satur 1mg līdz 5mg gosipola, ievieto 50 ml mērkolbā un pievieno 10 ml šķīdinātāja B (3.3.). Vienlaikus sagatavo tukšo mēģinājumu, ievietojot 10 ml šķīdinātāja B (3.3.) citā 50 ml mērkolbā. Abas kolbas silda 30 minūtes vāroša ūdens vannā. Atdzesē līdz istabas temperatūrai un abu kolbu saturu uzpilda līdz zīmei ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.). Homogenizē un atstāj nostādināšanai 10 – 15 minūtes, pēc tam filtrē un savāc filtrātus kolbās ar pieslīpētiem kakliem.
5.3.2. ar pipeti pārnes katrā no divām 25 ml mērkolbām 2 ml parauga filtrāta un katrā no divām citām 25 ml mērkolbām – 2 ml tukšā mēģinājuma filtrāta. Pēc tam katras sērijas vienas kolbas saturu uzpilda līdz 25 ml ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.). Šos šķīdumus izmanto kā salīdzināšanas šķīdumus.
5.3.3. pievieno 2 ml anilīna (3.4.) katrā no divām pārējām kolbām. Silda 30 minūtes vāroša ūdens vannā, lai attīstītu krāsu. Atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz 25 ml ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.), homogenizē un atstāj nostāvēties vienu stundu.
5.3.4. nosaka optisko blīvumu, kā norādīts 5.2. punktā, attiecībā uz brīvo gosipolu. No šā lieluma aprēķina kopējā gosipola saturu, kā norādīts 6. punktā.
6. Rezultātu aprēķināšana
Rezultātus var aprēķināt vai nu no īpatnējā optiskā blīvuma (6.1.), vai no kalibrācijas līknes (6.2.).
6.1. No īpatnējā optiskā blīvuma
Aprakstītajos apstākļos īpatnējie optiskie blīvumi ir šādi:
brīvam gosipolam: E1%1cm = 625
kopējam gosipolam: E1%1cm = 600
Brīvā vai kopējā gosipola saturu paraugā aprēķina pēc formulas:
E · 1250
gosipola % = –––––––––,
E1%1cm · p · a
kur
E – koriģētais optiskais blīvums noteikts saskaņā ar 5.2. punktu
p – parauga iesvars g
a – filtrāta alikvotā daļa ml
6.2. Aprēķināšana no kalibrēšanas līknes:
6.2.1. Brīvs gosipols;
6.2.1.2. sagatavo divas sērijas 25 ml mērkolbu pa piecām mērkolbām katrā. Katras sērijas mērkolbās ar pipeti ievada attiecīgi 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 un 10,0 ml gosipola standartšķīduma A (3.5.). Ar šķīdinātāju A (3.2.) uzpilda šķīdumus līdz 10 ml. Katru sēriju pabeidz ar tukšo paraugu, kas 25 ml mērkolbā satur tikai 10 ml šķīdinātāja A (3.2.).
6.2.1.2. pirmās sērijas kolbas, ieskaitot tukšo mēģinājumu, uzpilda ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.) līdz zīmei (salīdzināšanas rinda).
6.2.1.3. otrās sērijas kolbās, ieskaitot tukšo mēģinājumu, katrā pievieno 2 ml anilīna (3.4.). Pēc tam krāsas attīstīšanai 30 minūtes silda vāroša ūdens vannā, atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz zīmei ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.), sakrata un atstāj nostāvēties 1 stundu (standarta rinda).
6.2.1.4. izmēra standartrindas šķīdumu optisko blīvumu atbilstīgi 5.2. punkta nosacījumiem, salīdzinot ar atbilstīgiem salīdzināšanas rindas šķīdumiem. Uzzīmē kalibrācijas līkni, kurā atliek optiskā blīvuma lielumus pret gosipola daudzumiem µg.
6.2.2. Kopējais gosipols.
6.2.2.1. sagatavo sešas 50 ml mērkolbas. Pirmajā kolbā ar pipeti pārnes 10 ml šķīdinātāja B (3.3.) un pārējās 2,0, 4,0 6,0 8,0 un 10,0 ml gosipola standartšķīduma B (3.6.). Katras kolbas saturu ar šķīdinātāju B papildina līdz 10 ml, 30 minūtes silda vāroša ūdens vannā, atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz zīmei ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.) un sakrata.
6.2.2.2. šos šķīdumus ar pipeti pārnes pa 2 ml divās rindās pa sešām 25 ml mērkolbām.
6.2.2.3. pirmās rindas kolbas uzpilda līdz zīmei ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.) (salīdzināšanas rinda).
6.2.2.4. otrās rindas kolbās katrā pievieno 2 ml anilīna (3.4.). Pēc tam 30 minūtes karsē vāroša ūdens vannā, atdzesē līdz istabas temperatūrai, ar 2–propanola–heksāna maisījumu (3.1.) uzpilda līdz zīmei, sakrata un atstāj nostāvēties 1 stundu (standartrinda).
6.2.2.5. izmēra standartrindas šķīdumu optisko blīvumu atbilstīgi 5.2. punkta nosacījumiem, salīdzinot ar atbilstīgiem salīdzināšanas rindas šķīdumiem. Uzzīmē kalibrācijas līkni, kurā atliek optiskā blīvuma lielumus pret gosipola daudzumiem µg.
6.3. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
6.3.1. ja gosipola saturs ir mazāks par 500 ppm – 15 relatīvos procentus,
6.3.2. ja gosipola saturs ir 500 līdz 750 ppm – absolūto lielumu – 75 ppm,
6.3.3. ja gosipola saturs ir 750 ppm un vairāk – 10 relatīvos procentus.
Zemkopības ministrs M.Roze
21.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Tetraciklīna grupas antibiotiku noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka un identificē tetraciklīna grupas antibiotikas barībā, kas satur vismaz 1 ppm antibiotiku koncentrātos un premiksos.
2. Princips
Paraugu ekstrahē ar metilspirta un sālsskābes maisījumu. Ekstraktu un salīdzināšanas šķīdumus salīdzināšanai pakļauj augšup ejošai papīra hromatogrāfijai. Antibiotikas konstatē un identificē, salīdzinot to Rf lielumus ar standartvielu Rf lielumiem pēc fluorescences UV gaismā (ja ir liels antibiotiku saturs) vai pēc bioautogrāfijas uz agara barotnes, kurai uzsēts B. cereus.
3. Reaģenti un barotne
3.1. Buferšķīdums pH 3,5:
10,256 g citronskābes monohidrāts – analītiski kvalitatīvs;
7,45 g nātrija hidrogēnfosfāts Na2HPO4·2H2O – analītiski kvalitatīvs;
300 ml acetones – analītiski kvalitatīvs;
destilēts ūdens līdz 1000 ml.
3.2. Fosfāta buferšķīdums pH 5,5:
130,86 g kālija dihidrogenfosfāts KH2PO4 – analītiski kvalitatīvs;
6,947 g nātrija hidrogēnfosfāts Na2HPO4·2H2O – analītiski kvalitatīvs;
destilēts ūdens līdz 1000 ml.
3.3. Eluents I: tīra nitrometāna, tīra hloroforma un 1,3–dihlor–2–propanola maisījums –20:10:1,5 tilpuma daļas – jāsagatavo tieši pirms lietošanas
3.4. Eluents II: tīra nitrometāna, tīra hloroforma un 2–pikolīna maisījums – 20:10:3 tilpuma daļas – jāsagatavo tieši pirms lietošanas;
3.5.Tīra metilspirta un sālsskābes (d = 1.19) maisījums – 98:2 tilpuma daļas;
3.6. 0,1 N sālsskābe ;
3.7. Amonija hidroksīds – d = 0,91;
3.8. Standartvielas: hlortetraciklīns, oksitetraciklīns, tetraciklīns, kuru aktivitāte ir izteikta, rēķinot uz hidrohlorīdiem;
3.9. Mikroorganisms: B. cereus ATCC nr. 11.778;
Kultūras uzturēšana, sporu suspensijas pagatavošana un barotnes uzsēšana: rīkojas, kā aprakstīts hlortetraciklīna, oksitetraciklīna un tetraciklīna satura noteikšanas metodes (ar difūziju agarā) 3.1. un 3.2. apakšpunktā. Metodes apraksts ir šajā pielikumā.
3.10.Barotne 1:
1 g glikozes;
10 g triptiskā peptona;
1,5 g gaļas ekstrakta;
3 g rauga ekstrakta;
20g agara;
destilēts ūdens līdz 1000 ml
Tieši pirms lietošanas noregulē pH līdz 5,8;
3.11. 0,1 % (masa/tilp.) 2,3,5–trifeniltetrazolija hlorīda šķīdums un 5 % (masa/tilp.) glikozes šķīdums.
4. Aparatūra
4.1. Augšupejošās papīra hromatogrāfijas aparāts (papīra augstums 25 cm) – Schleicher&Schuell papīrs ( 2040B vai 2043B ) vai līdzvērtīgs;
4.2. Centrifūga;
4.3. Inkubators – ieregulēts uz 30 oC;
4.4. UV lampa fluorescences konstatēšanai;
4.5. Stikla plāksnes – aptuveni 20 x 30 cm bioautogrāfijai.
5. Standartšķīdumi
5.1. Izejas šķīdumi
Izmantojot sālsskābi (3.6.), no standartvielām (3.8.) pagatavo šķīdumus ar koncentrācijām, kas atbilst 500 µg/ml hlortetraciklīna hidrohlorīda, oksitetraciklīna hidrohlorīda un tetraciklīna hidrohlorīda
5.2. Salīdzināšanas šķīdums konstatēšanai UV gaismā
Atšķaida šķīdumus (5.1.) ar fosfāta buferšķīdumu (3.2.), lai iegūtu šķīdumus ar koncentrācijām, kas atbilst 100 µg/ml hlortetraciklīna hidrohlorīda, oksitetraciklīna hidrohlorīda un tetraciklīna hidrohlorīda
5.3. Salīdzināšanas šķīdums konstatēšanai ar bioautogrāfiju
Atšķaida šķīdumus (5.1.) ar fosfāta buferšķīdumu (3.2.), lai iegūtu šķīdumus ar koncentrācijām, kas atbilst 5 µg/ml hlortetraciklīna hidrohlorīda, oksitetraciklīna hidrohlorīda un tetraciklīna hidrohlorīda
6. Ekstrahēšana
6.1. ja paredzamais antibiotiku saturs ir mazāks par 10 ppm, tad var izmantot homogenizētu paraugu vai, sijājot atdalīto smalkāko frakciju, jo antibiotikas atrodas galvenokārt šajā frakcijā.
6.2. paraugu suspendē maisījumā (3.5.) un centrifugē. Centrifugātu savāc un izmanto tieši vai vajadzības gadījumā atšķaida ar maisījumu (3.5.), lai iegūtu antibiotiku koncentrācijas aptuveni 100 µg/ml (6.1.) un 5 µg/ml (6.2.).
7. Noteikšana un identificēšana
7.1. Hromatogrāfija
7.1.1. iegremdē papīru buferšķīdumā ar pH 3,5 (3.1.). Aizvada lieko šķidrumu, nospiežot papīru starp sausa filtrpapīra loksnēm. Pēc tam uz papīra uzpilina 0,01 ml salīdzināšanas šķīdumu (5.2. un 5.3.) un ekstraktu (6.1. un 6.2.). Lai panāktu labu sadalīšanu, jābūt pareizam papīra mitrumam, vajadzības gadījumā to atstāj nedaudz pažāvēties.
7.1.2. hromatografē ar augšupejošās hromatogrāfijas metodi. Noteikšanai ar bioautogrāfiju izmanto eluentu I (3.3.) un konstatēšanai UV gaismā izmanto eluentu II (3.4.). Kad šķīdinātāja fronte ir pacēlusies par 15 līdz 20 cm (aptuveni 1 stunda 30 minūtes), hromatografēšanu pārtrauc un papīru izžāvē.
7.2. Konstatēšana UV gaismā
Ja antibiotiku līmenis ir lielāks par 1 µg/cm2, tad pēc hromatogrammas apstrādes ar amonjaka tvaikiem (3.7.) UV spuldzes (4.4.) starojumā ir redzami zeltdzelteni fluorescējoši plankumi.
7.3. Noteikšana ar bioautogrāfiju
7.3.1. izlej barotni (3.10.), kurā iepriekš iesēts B. cereus (3.9.), stikla platēs (4.5.) un uzliek papīru uz barotnes. Pēc 5 minūšu saskares papīru noņem un uzliek to citam plankumam barotnē, kur papīrs paliek inkubācijas perioda laikā. Inkubē vienu nakti 30oC temperatūrā. Ja ir klāt tetraciklīna grupas antibiotika, duļķainajā barotnē parādās gaišas inhibīcijas zonas.
7.3.2. pēc inkubācijas iztvaicē šķīdumu (3.11.), lai hromatogrammu fiksētu uz papīra.
7.4. Identifikācija
7.4.1. tetraciklīnu grupas antibiotiku relatīvie Rf lielumi ir doti turpmāk. Šie lielumi var nedaudz mainīties atkarībā no papīra kvalitātes un tā mitruma satura:
7.4.1.1. Hlortetraciklīns (CTC) 0,60
7.4.1.2. Tetraciklīns (TC) 0,40
7.4.1.3. Oksitetraciklīns (OTC) 0,20
7.4.1.4. 4–Epi–CTC 0.15
7.4.1.5. 4–Epi–TC 0,13
7.4.1.6. 4–Epi–OTC 0,10
7.4.2. Epi–savienojumu antibiotiskā aktivitāte ir mazāka par parasto savienojumu antibiotisko aktivitāti.
Zemkopības ministrs M.Roze
22.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Hlortetraciklīna, oksitetraciklīna un tetraciklīna noteikšana
1. Ar difūzijas metodi agara barotnē
1.1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka hlortetraciklīna (CTC), oksitetracilīna (OTC) un tetraciklīna (TC) līmeni barībā, koncentrātos un premiksos, ja koncentrācijas ir lielākas par 5 ppm. Saturu, kas mazāks par 5 ppm, var noteikt ar grafisko interpolāciju.
1.2. Princips
1.2.1. ja saturs ir 50 ppm vai mazāks, paraugu ekstrahē ar atšķaidītu formamīdu. Ja saturs ir lielāks par 50 ppm, to CTC noteikšanai ekstrahē ar acetona, ūdens un sālsskābes maisījumu. OTC un TC noteikšanai ekstrahē ar metilspirta un sālsskābes maisījumu.
1.2.2. pēc tam ekstraktus atšķaida un to antibiotisko aktivitāti nosaka, izmērot CTC, OTC vai TC difūziju agara barotnē, kurā iesēts B. cereus. Par difūziju liecina inhibīcijas zonu veidošanās mikroorganisma klātbūtnē. Šo zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotiku koncentrācijas logaritmam.
1.3. Mikroorganisms: B. cereus, ATCC nr. 11.778.
1.3.1. Kultūras uzturēšana
Mēģeni ar slīpagaru, kurā iesēts B. cereus, kas ņemts no barotnes (1.4.1.) bez metilēnzilā un borskābes, inkubē vienu nakti aptuveni 30oC temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī un slīpagaru pārsēj reizi 14 dienās.
1.3.2. Sporu suspensijas pagatavošana
1.3.2.1. ar 2 – 3 ml fizioloģiskā šķīduma (1.4.5.) noskalo kultūras augumu no slīpagara (1.3.1.) virsmas. Šo suspensiju iesēj Rū (Roux) kolbā, kas satur 300 ml barotnes (1.4.1.) (bez metilēnzilā un borskābes) ar agara koncentrāciju 2 – 4 %. Inkubē 3 – 5 dienas 28 – 30oC temperatūrā, sporu veidošanos novēro mikroskopā, pēc tam savāc sporas 15 mililitros etilspirta (1.4.6.) un homogenizē. Suspensija ir glabājama ledusskapī 5 mēnešus un ilgāk.
1.3.2.2. priekšmēģinājumos uz platēm ar noteikšanas pamatbarotni (1.4.1.) nosaka uzsējamā materiāla daudzumu, kas dažādām izmantojamo antibiotiku koncentrācijām veido iespējami lielākās inhibēšanas zonas, kas vēl ir skaidri izteiktas. Šis daudzums parasti ir starp 0,2 un 0,3 ml uz 1000 ml. Inokulēšanu barotnē veic temperatūrā starp 50 un 60oC.
1.4. Barotne un reaģenti
1.4.1. Pamatbarotne noteikšanai 1:
1 g glikoze;
10 g triptiskais peptons;
1,5 g gaļas ekstrakts;
3 g rauga ekstrakts;
10 – 20 g agars, atkarībā no kvalitātes;
1 ml “Tween 80”;
10 ml fosfāta buferšķīdums pH 5,5 (4.2.);
15 ml 5 % (m/V) borskābes šķīdums;
4 ml 0,5 % metilēnzilā šķīdums etilspirtā;
destilēts ūdens līdz 1000 ml.
Pirms lietošanas noregulē pH 5,8;
1.4.2. Fosfāta buferšķīdums, pH 5,5:
130,86 g kālija dihidrogenfosfāts KH2PO4 – analītiski kvalitatīvs;
6,947 g nātrija hidrogēnfosfāts Na2HPO4·2H2O – analītiski kvalitatīvs;
destilēts ūdens līdz 1000 ml;
1.4.3.Fosfāta buferšķīdums pH 5,5 atšķaidīts attiecībā 1/10;
1.4.4. Fosfāta buferšķīdums, pH 8:
1,407 g kālija dihidrogenfosfāts KH2PO4 – analītiski kvalitatīvs;
57,539 g dinātrija hidrogenfosfāts Na2HPO4 ·2H2O – analītiski kvalitatīvs;
destilēts ūdens līdz 1000 ml;
1.4.5. Sterils fizioloģiskais šķīdums;
1.4.6. 20 % (V/V) etilspirts;
1.4.7. 0,1 N sālsskābe;
1.4.8. 70 % (V/V) formamīds: pagatavo svaigu pirms lietošanas un noregulē pH 4,5 ar aptuveni 2 N sērskābi;
1.4.9.Tīra acetona, ūdens un sālsskābes (d = 1,19) maisījums – 65:33:2 tilpuma daļas;
1.4.10. Tīra metilspirta un sālsskābes (d = 1,19) maisījums – 98:2 tilpuma daļas;
1.4.11. Standartvielas: hlortetraciklīns, oksitetraciklīns, tetraciklīns, kuru aktivitāte ir izteikta, rēķinot uz hidrohlorīdiem.
1.5. Standartšķīdumi
1.5.1. Hlortetraciklīns
1.5.1.1. izmantojot sālsskābi (1.4.7.), no standartvielas (1.4.11.) pagatavo izejas šķīdumu ar koncentrāciju, kas atbilst 500 µg/ml hlortetraciklīna hidrohlorīda. Šis šķīdums ir glabājams ledusskapī vienu nedēļu.
1.5.1.2. no šā izejas šķīduma pagatavo darba standartšķīdumu S8 ar koncentrāciju, kas atbilst 0,2 µg/ml hlortetraciklīna hidrohlorīda. Atšķaidīšanu izdara ar fosfāta buferšķīdumu pH 5,5, kas ir atšķaidīts attiecībā 1:10 (1.4.3.) un kam ir pievienots 0,01 % amīdmelnā 2.
1.5.1.3. pēc tam secīgu atšķaidīšanu gaitā (1 +1), izmantojot buferšķīdumu (1.4.3.), pagatavo šādas koncentrācijas: S4 0,1 µg/ml, S2 0,05 µg/ml un S1 0,025µg/ml.
1.5.2. Oksitetraciklīns
Rīkojoties, kā norādīts 1.5.1.apakšpunktā, no izejas šķīduma ar koncentrāciju, kas atbilst 400 µg/ml oksitetraciklīna hidrohlorīda, pagatavo standarta darba šķīdumu S8, kas satur 1,6 µg/ml oksitetraciklīna hidrohlorīda, un pagatavo šādas koncentrācijas: S4 0,8 µg/ml, S2 0,4 µg/ml un S1 0,2 µg/ml.
1.5.3. Tetraciklīns
Rīkojoties, kā norādīts 1.5.1.apakšpunktā, no izejas šķīduma ar koncentrāciju, kas atbilst 500 µg/ml tetraciklīna hidrohlorīda, pagatavo standarta darba šķīdumu S8, kas satur 1,0 µg/ml tetraciklīna hidrohlorīda, un pagatavo šādas koncentrācijas: S4 0,5 µg/ml, S2 0,25 µg/ml un S1 0,125 µg/ml.
1.6. Ekstrahēšana
1.6.1. Saturs 50 ppm vai mazāk
1.6.1.1. analizējamam paraugam pievieno formamīdu (1.4.8.) turpmāk dotajā tabulā norādītajos daudzumos. Ar kratītāju krata 30 minūtes. Tūlīt pēc tam atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (1.4.3.) saskaņā ar zemāk tabulā dotajiem norādījumiem, lai iegūtu koncentrāciju U8. Šā šķīduma formamīda koncentrācija nedrīkst pārsniegt 40 %.
1.6.1.2. centrifugē vai dekantē, lai iegūtu dzidru šķīdumu. Pēc tam secīgu atšķaidīšanu gaitā (1 +1), izmantojot fosfāta buferšķīdumu (1.4.3.), pagatavo koncentrācijas U4, U2 un U1.
|
Antibiotika |
CTC |
OTC |
TC |
|||
|
Paredzamais saturs ppm |
10 |
50 |
10 |
50 |
10 |
50 |
|
Parauga iesvars g |
10 |
10 |
24 |
9,6 |
20 |
10 |
|
Formamīds ml (4.8.) |
100 |
100 |
80 |
100 |
80 |
100 |
|
Fosfāta buferšķīdums (4.3.) |
Atšķ.1: 5 (a) |
Atšķ. 1: 25 (b) |
70 |
200 |
120 |
atšķ.1:5 (a) |
|
Koncentrācija U8 μg/ml |
0,2 |
0,2 |
1,6 |
1,6 |
1,0 |
1,0 |
(a) Ņem 20 ml ekstrakta un 100 ml mērkolbā uzpilda ar fosfāta buferšķīdumu līdz zīmei.
(b) Ņem 4 ml ekstrakta un 100 ml mērkolbā uzpilda ar fosfāta buferšķīdumu līdz zīmei.
1.6.2. Saturs lielāks par 50 ppm
1.6.2.1. Hlortetraciklīns
Atkarībā no paredzamā antibiotiku satura paraugā vai tā izgatavotāja garantijām 2–10 g analizējamā parauga pievieno 20 reižu lielāku tilpumu maisījuma (1.4.9.). Ar kratītāju krata 30 minūtes. Ekstrahēšanas laikā pH ir jāpaliek mazākam par 3. Vajadzības gadījumā pH vēlreiz noregulē uz 3 (neorganiskiem maisījumiem izmanto 10 % etiķskābi). Ņem ekstrakta alikvotu daļu un, izmantojot fosfāta buferšķīdumu ar pH 8 1.4.4.), noregulē pH uz 5,5 bromkrezola zaļā klātbūtnē (krāsa mainās no dzeltenas uz zilu). Atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu pH 5,5, kas ir atšķaidīts attiecībā 1:10 (1.4.3.), lai iegūtu koncentrāciju U8 (sk. 1.6.1.). Pēc tam secīgu atšķaidīšanu gaitā (1 + 1), izmantojot fosfāta buferšķīdumu (1.4.3.), pagatavo koncentrācijas U4, U2 un U1.
1.6.2.2. Oksitetraciklīns un tetraciklīns
Rīkojas, kā norādīts 1.6.2.1.apakšpunktā, izmantojot maisījuma (1.4.9.) vietā maisījumu (1.4.10.).
1.7. Noteikšanas metode
1.7.1. Inokulācija barotnē
Noteikšanai sporu suspensiju (1.3.2.) iesēj pamatbarotnē (1.4.1.) 50 – 60oC temperatūrā
1.7.2. Paplāšu sagatavošana
1.7.2.1. difūziju agarā izdara platēs, izmantojot 4 standartšķīduma koncentrācijas (S8, S4, S2, S1) un 4 ekstrakta koncentrācijas (U8, U4, U2, U1). Četras ekstrakta un standartšķīduma koncentrācijas ir jāievieto katrā platē.
1.7.2.2. tādēļ izvēlas plates, kas ir pietiekami lielas, lai tajās agara barotnē varētu izveidot vismaz 8 dobumus ar 10 – 13 mm diametru. Aprēķina apsētās barotnes (1.7.1.) daudzumu, kas vajadzīgs, lai nodrošinātu viendabīgu aptuveni 2 mm biezu pārklājumu. Analīzi vēlams izdarīt uz platēm, kas sastāv no plakana stikla plāksnēm, kuras aprīkotas ar pilnīgi horizontālu alumīnija vai plastmasas gredzenu ar 200 mm diametru un 20 mm augstumu.
1.7.2.3. dobumos ar pipeti iepilina antibiotiku šķīduma precīzi nomērītus daudzumus starp 0,10 un 0,15 ml atkarībā no dobumu diametra.
1.7.2.4. katram paraugam difūziju atkārto vismaz 4 reizes ar katru koncentrāciju, lai katra noteikšana ietvertu 32 inhibēšanas zonu novērtējumu.
1.7.3. Inkubācija
Plates inkubē aptuveni 18 stundas 28 – 30 oC temperatūrā.
1.8. Novērtēšana
1.8.1. izmēra inhibēšanas zonu diametru, vēlams ar projicēšanu. Reģistrē mērījumus uz puslogaritmiskā papīra, atliekot koncentrācijas logaritmu pret kavēšanas zonu diametru. Uzzīmē standartšķīduma un ekstrakta līniju. Abas līnijas ir paralēlas pie nosacījuma, ka nepastāv traucējumi.
1.8.2. relatīvās aktivitātes logaritmu aprēķina, izmantojot šādu formulu:
(U1 +
U2 + U4 +
U8 – S1 –
S2 – S4 –
S8) · 0,602
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
U4 + U8 +
S4 + S8 – U1 –
U2 – S1 –
S2
Faktiskā aktivitāte = paredzamā aktivitāte x relatīvā aktivitāte.
1.9. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10 % pēc relatīvā lieluma.
2. Ar tubidimetriju
2.1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka hlortetraciklīna (CTC), oksitetraciklīna (OTC) un tetraciklīna (TC) līmeņus, ja koncentrācijas ir lielākas par 1 g/kg ar nosacījumu, ka nepastāv citu vielu traucējošā iedarbība, kas duļķo ekstraktus. Šī metode ir ātrāka nekā difūzija agarā.
2.2. Princips
2.2.1. CTC noteikšanai paraugu ekstrahē ar acetona, ūdens un sālsskābes maisījumu, bet OTC un TC noteikšanai to ekstrahē ar metilspirta un sālsskābes maisījumu.
2.2.2. Ekstraktus pēc tam atšķaida un to antibiotisko ietekmi nosaka, mērot gaismas caurlaidību barotnei, kurā iesēts Staphylococcus aureus un kurā pievienota antibiotika. Gaismas caurlaidība ir atkarīga no antibiotiku koncentrācijas.
2.3. Mikroorganisms: Staphylococcus aureus K 141 3
2.3.1. Kultūras uzturēšana
S. aureus iesēj mēģenē ar slīpagaru, kas ņemts no barotnes (2.4.1.), kurai pievienots 1,5 – 3 % agara (atkarībā no kvalitātes), inkubē vienu nakti 37oC temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī un slīpagaru no jauna pārsēj reizi 4 nedēļās. Vienlaikus sagatavo darba kultūras lietošanai laboratorijā.
2.3.2. Uzsējuma sagatavošana
24 stundas pirms lietošanas uz slīpagara uzsēj darba kultūru un inkubē vienu nakti 37oC temperatūrā. Visu mēģenē uz agara esošo kultūras augumu suspendē aptuveni 2 ml pamatbarotnes (2.4.1.), pēc tam sterilos apstākļos suspensiju pārnes aptuveni 100 ml tās pašas pamatbarotnes (2.4.1.). Inkubē ūdens vannā 37oC temperatūrā, līdz klona augšana ieiet logaritmiskā fāzē (1 stunda 30 minūtes līdz 2 stundām).
2.4. Barotne un reaģenti
2.4.1. Pamatbarotne noteikšanai 1:
5 g peptons;
1,5 g rauga ekstrakts;
1,5 g gaļas ekstrakts;
3,5 g nātrija hlorīds;
1,0 g glikoze;
1.32 g kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4 – analītiski kvalitatīvs;
3.68 g kālija hidrogēnfosfāts K2HPO4 – analītiski kvalitatīvs;
destilēts ūdens līdz 1000 ml.
pH pēc sterilizācijas 6,8 līdz 7,0;
2.4.2. Fosfāta buferšķīdums, pH 4,5:
13,6 g kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4 – analītiski kvalitatīvs;
destilēts ūdens līdz 1000 ml;
2.4.3. 0,1 N sālsskābe;
2.4.4. Tīra acetona, ūdens un sālsskābes (d = 1,19) maisījums – 65:33:2 tilpuma daļas;
2.4.5. Tīra metilspirta un sālsskābes (d = 1,19) maisījums – 98:2 tilpuma daļas;
2.4.6. Aptuveni 10 % (m/V) formaldehīda šķīdums;
2.4.7. Standartvielas: hlortetraciklīns, oksitetraciklīns, tetraciklīns, kuru aktivitāte ir izteikta, rēķinot uz hidrohlorīdiem.
2.5. Standartšķīdums
Izmantojot sālsskābi (2.4.3.), no standartšķīduma (2.4.7.) pagatavo izejas šķīdumu ar koncentrāciju, kas atbilst 500 µg/ml CTC–HCl, OTC–HCl vai TC–HCl. Šis šķīdums ir glabājams ledusskapī vienu nedēļu.
2.6. Ekstrahēšana
2.6.1. Hlortetraciklīns
200 vai 250 ml mērkolbā ievieto 1 līdz 2 g analizējamā parauga. Pievieno aptuveni 100 ml maisījuma (2.4.4.) un ar kratītāju krata 30 minūtes. Ar fosfāta buferšķīdumu pH 4,5 (2.4.2.) uzpilda līdz atzīmei. Homogenizē un atstāj nostāties.
2.6.2. Oksitetraciklīns un tetraciklīns
200 vai 250 ml mērkolbā ievieto 1 līdz 2 g analizējamā parauga. Pievieno aptuveni 100 ml maisījuma (4.5.) un ar kratītāju krata 30 minūtes. Ar fosfāta buferšķīdumu pH 4,5 (2.4.2.) uzpilda līdz atzīmei. Homogenizē un atstāj nostāvēties.
2.7. Noteikšanas metode
2.7.1. Ekstrakta un standartsērijas pagatavošana
Ar fosfāta buferšķīdumu pH 4,5 (2.4.2.) atšķaida standartšķīdumu (2.5.) un ekstraktu (2.6.), lai iegūtu koncentrāciju sēriju. Katrai noteikšanai no attiecīgās koncentrācijas uzzīmē kalibrēšanas līkni, lai varētu interpolēt vismaz divus lielumus, kas attiecas uz ekstraktu. Atšķaidījumus būtu jāizvēlas saskaņā ar klona audzēšanas apstākļiem, kas dažādās laboratorijās var būt atšķirīgi. Darba gaita parasti ir šāda:
2.7.1.1. Hlortetraciklīns
Standartšķīdumu (2.5.) atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.), lai iegūtu standarta darba šķīdumu ar koncentrāciju, kas atbilst 0,2 µg/ml CTC·HCl. Pēc tam ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.) mēģenēs, kā turpmāk norādīts, pagatavo 6 atšķaidījumus, katru atšķaidījumu divos eksemplāros.
|
Darba standartšķīdums, ml |
Fosfāta buferšķīdums (4.2.), ml |
CTC·HCl koncentrācija (µg/ml) |
|
0,7 0,6 0,55 0,45 0,4 0,3 |
0,3 0,4 0,45 0,55 0,6 0,7 |
0,14 0,12 0,11 0,09 0,08 0,06 |
Ekstraktu (2.6.1.) atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.), lai iegūtu paredzamo CTC·HCl koncentrāciju 0,12 µg/ml. Šā šķīduma 1 ml ievieto katrā no 2 mēģenēm un katrā no 2 citām mēģenēm ievieto 0,75 ml (=0,09µg). Uzpilda abu pēdējo mēģeņu tilpumu līdz 1 ml ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.).
2.7.1.2. Oksitetraciklīns un tetraciklīns
2.7.1.2.1. Standartšķīdumu (5.) atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.), lai iegūtu standarta darba šķīdumu ar koncentrāciju, kas atbilst 0,6 µg/ml OTC·HCl vai TC·HCl. Pēc tam ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.) mēģenēs, kā turpmāk norādīts, pagatavo 7 atšķaidījumus, katru atšķaidījumu divos eksemplāros.
|
Darba standartšķīdums, ml |
Fosfāta buferšķīdums (4.2.), ml |
OTC·HCl vai TC·HCl koncentrācija (µg/ml) |
|
0,9 0,8 0,7 0,6 0,4 0,3 0,2 |
0,1 0,2 0,3 0,4 0,6 0,7 0,8 |
0,54 0,48 0,42 0,36 0,24 0,18 0,12 |
2.7.1.2.2. ekstraktu (2.6.2.) atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.), lai iegūtu paredzamo OTC·HCl vai TC·HCl koncentrāciju 0,48 µg/ml. Šā šķīduma 1 ml ievieto katrā no divām mēģenēm un katrā no divām citām mēģenēm ievieto 0,5 ml (=0,24 µg). Uzpilda abu pēdējo mēģeņu tilpumu līdz 1 ml ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.).
2.7.2. Inokulēšana barotnē
Inokulē noteikšanas pamatbarotni (2.4.1.) ar uzsējumu (2.3.2.), lai ar fotometru pie 590 nm iegūtu gaismas caurlaidību 85 % 5 cm kivetē vai 92 % caurlaidību 2 cm kivetē, ja aparāts ir noregulēts tā, lai 100 % caurlaidība būtu neinokulētā pamatbarotnē (2.4.1.).
2.7.3. Inokulēšana
Katrā mēģenē (2.7.1.1. vai 2.7.1.2.) ievieto 9 ml inokulētas barotnes (2.7.2.). Mēģenes ir jāpilda tīros, bet ne obligāti sterilos apstākļos.
2.7.4. Inkubācija
Jāinkubē ūdens vannā, kurā maisot uztur nemainīgu 37 ± 0,1oC temperatūru. Izraudzītajam inkubācijas periodam (parasti 2 stundas 30 minūtes līdz 3 stundas) jābūt tādam, lai būtu iespējams caurlaidības līknes uzzīmēt ar slīpumiem, kas ir pietiekami precīziem mērījumiem. Pēc tam augšanu pārtrauc, katrā mēģenē strauji iesmidzinot 1 ml formaldehīda šķīduma (2.4.6.).
2.7.5. Augšanas mērījumi
Ar fotometru pie 590 nm izmēra caurlaidību, noregulējot aparātu uz 100% caurlaidību dzidrākajam standartšķīdumam (kas atbilst lielākajam antibiotikas saturam). Tā kā dažādu mēģeņu uzrādītās duļķainības atšķirības ir nelielas, būtu jāizmanto vismaz 2 cm kivetes, bet vēlams 5cm kivetes.
2.8. Rezultātu aprēķināšana
Uz milimetru papīra uzzīmē kalibrācijas līkni, atliekot fotometrisko caurlaidību pret antibiotiku koncentrācijām. Interpolē ekstrakta caurlaidības lielumus uz līknes. Aprēķina parauga antibiotikas saturu.
2.9. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10% pēc relatīvā lieluma.
Zemkopības ministrs M.Roze
23.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Oleandomicīna noteikšana ar difūzijas metodi agara barotnē
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka oleandomicīna saturu barībā, koncentrātos un premiksos, kas satur vairāk par 0,5 ppm oleandomicīna arī tetraciklīna grupas antibiotiku klātbūtnē.
2. Princips
Paraugu ekstrahē ar tri(hidroksimetilamino)metāna atšķaidītu šķīdumu metilspirtā. Pēc centrifugēšanas ekstraktu atšķaida un tā antibiotisko aktivitāti nosaka, izmērot oleandomicīna difūziju agara barotnē, kurā iesēta B. cereus kultūra. Par difūziju liecina ihibēšanas zonu veidošanās mikroorganisma klātbūtnē. Šo zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotiku koncentrācijas logaritmam.
3. Mikroorganisms: B.cereus K 250 TR4 (rezistents pret tetraciklīniem)
3.1. Kultūras uzturēšana
B. cereus iesēj mēģenē ar slīpagaru, kas ņemts no barotnes (4.1.), kam pievienoti 100 µg oksitetraciklīna uz 5 ml barotnes, inkubē vienu nakti aptuveni 30°C temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī un slīpagaru no jauna pārsēj reizi 4 nedēļās.
3.2. Sporu suspensijas pagatavošana
Ar aptuveni 3 ml fizioloģiskā šķīduma (4.3.) noskalo kultūras augumu no slīpagara virsmas (3.1.). Šo suspensiju iesēj Rū (Roux) kolbā, kas satur 300 ml barotnes (4.1.), kuras agara koncentrācija ir 3 – 4 %. Inkubē 3 līdz 5 dienas 28 – 30oC temperatūrā, sporu veidošanos pārbauda mikroskopā, pēc tam savāc sporas 15 mililitros etilspirta (4.4.) un homogenizē. Suspensiju var uzglabāt ledusskapī 5 mēnešus un ilgāk.
3.3. Priekšmēģinājumos uz plāksnēm ar noteikšanas pamatbarotni (4.2.) nosaka uzsējamā materiāla daudzumu, kas dažādām oleandomicīna koncentrācijām rada iespējami lielākās inhibēšanas zonas, kuras vēl ir skaidri izteiktas. Šis daudzums parasti ir starp 0,1 un 0,2 ml uz 1000 ml. Inokulēšanu barotnē veic 60°C temperatūrā.
4. Barotne un reaģenti
4.1. Barotne kultūras uzturēšanai 1:
1 g glikoze;
10 g triptiskais peptons;
1,5 g gaļas ekstrakts;
3 g rauga ekstrakts;
10 – 20 g agars – atkarībā no kvalitātes;
destilēts ūdens līdz 1000 ml.
Tieši pirms lietošanas noregulē pH uz 6,5;
4.2. Pamatbarotne noteikšanai 1:
barotne (4.1.) – ar pH 8,8;
4.3. Sterils fizioloģiskais šķīdums;
4.4. 20 % (V/V) etilspirts;
4.5. Tīrs metilspirts;
4.6. Tri (hidroksimetilamino) metāna 0,5 % (m/V) šķīdums – analītiski kvalitatīvs;
4.7. Ekstrahēšanas šķīdums:
50 ml tīrs metilspirts;
50ml destilēts ūdens;
0,5 g tri (hidroksimetilamino) metāns – analītiski kvalitatīvs;
4.8. Standartviela: zināmas aktivitātes oleandomicīns.
5. Standartšķīdums
5.1. Standartvielu (4.8.) izšķīdina 5 ml metilspirta (4.5.) un atšķaida ar šķīdumu (4.6.), lai iegūtu oleandomicīna koncentrāciju 100 µg/ml.
5.2. No šā izejas šķīduma, atšķaidot ar šķīdumu (4.6.), pagatavo standarta darba šķīdumu S8, kas satur 0,1 µg/ml oleandomicīna. Pēc tam secīgu atšķaidīšanu gasitā (1 +1), izmantojot šķīdumu (4.6.), pagatavo šādas koncentrācijas: S4 0,05 µg/ml, S2 0,025 µg/ml un S1 0,0125 µg/ml.
6. Ekstrahēšana
6.1. Atkarībā no paredzamā oleandomicīna satura paraugā 2–10 g analizējamā parauga pievieno 100 ml šķīduma (4.7.) un krata 30 minūtes ar kratītāju.
6.2. Centrifugē, ņem ekstrakta alikvotu daļu un atšķaida ar šķīdumu (4.6.), lai iegūtu paredzamo oleandomicīna koncentrāciju 0,1 µg/ml (= U8). Pēc tam secīgu atšķaidīšanu gaitā (1 +1), izmantojot šķīdumu (4.6.), pagatavo koncentrācijas U4, U2 un U1.
7. Noteikšanas metode
7.1. Inokulēšana barotnē
Sporu suspensiju (3.2.) iesēj noteikšanas pamatbarotnē (4.2.) 60oC temperatūrā.
7.2. Plašu sagatavošana
7.2.1. Difūziju agarā izdara platēs, izmantojot 4 standartšķīduma koncentrācijas (S8, S4, S2, S1) un 4 ekstrakta koncentrācijas (U8, U4, U2, U1). Četras ekstrakta un standartšķīduma koncentrācijas ir jāievieto katrā paplātē.
7.2.2. Tādēļ izvēlas plates, kas ir pietiekami lielas, lai tajās agara barotnē varētu izveidot vismaz 8 iedobumus ar 10 – 13 mm diametru. Aprēķina inokulētās barotnes (7.1.) daudzumu, kas vajadzīgs, lai nodrošinātu viendabīgu, aptuveni 2 mm biezu pārklājumu. Analīzi vēlams veikt uz platēm, kuras sastāv no plakana stikla plāksnēm, kas aprīkotas ar pilnīgi horizontālu alumīnija vai plastmasas gredzenu, kura diametrs ir 200 mm un augstums 20 mm.
7.2.3. Dobumos ar pipeti pārnes antibiotikas šķīduma precīzi nomērītus daudzumus starp 0,10 un 0,15 ml atkarībā no dobumu diametra.
7.2.4. Katram paraugam difūziju atkārto vismaz 4 reizes ar katru koncentrāciju, lai katra noteikšana ietvertu 32 inhibēšanas zonu novērtējumu.
7.3. Inkubācija
Plates inkubē aptuveni 18 stundas 28 – 30 oC temperatūrā
8. Novērtēšana
8.1. Izmēra inhibēšanas zonu diametru, vēlams ar projicēšanu. Reģistrē mērījumus uz puslogaritmiskā papīra, atliekot koncentrācijas logaritmu pret kavēšanas zonu diametru. Uzzīmē standartšķīduma un ekstrakta kalibrēšanas līnijas. Ar nosacījumu, ka nenotiek traucēšana, abas līnijas ir paralēlas.
Relatīvās aktivitātes logaritmu aprēķina, izmantojot šādu formulu:
(U1 +
U2 + U4 +
U8 – S1 –
S2 – S4 –
S8) · 0,602
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
U4 + U8 +
S4 + S8 – U1 –
U2 – S1 –
S2
8.2. Faktiskā aktivitāte = paredzamā aktivitāte x relatīvā aktivitāte.
9. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10% pēc relatīvā lieluma.
Zemkopības ministrs M.Roze
24.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Tilozīna noteikšana ar difūzijas metodi agara barotnē
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka tilozīna saturu barībā, koncentrātos un premiksos, ja koncentrācija ir lielāka par 2 ppm.
2. Princips
Paraugu apstrādā ar fosfāta buferšķīdumu pH8, kas iepriekš uzkarsēts līdz 80oC, un pēc tam ekstrahē ar metilspirtu. Pēc centrifugēšanas ekstraktu atšķaida un tā antibiotisko aktivitāti nosaka, izmērot tilozīna difūziju agara barotnē, kurā iesēta Sarcina lutea kultūra. Par difūziju liecina inhibēšanas zonu veidošanās mikroorganisma klātbūtnē. Šo zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotiku koncentrācijas logaritmam.
3. Mikroorganisms: Sarcina lutea ATCC nr. 9341
3.1. Kultūras uzturēšana
Mēģeni ar slīpagaru, kurā iesēta Sarcina lutea un ieregulēts pH 7,0, inkubē vienu nakti aptuveni 35oC temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī un slīpagaru pārsēj reizi mēnesī.
3.2. Baktēriju suspensijas pagatavošana
Ar aptuveni 2–3 ml fizioloģiskā šķīduma (4.4.) noskalo kultūras augumu no slīpagara (3.1.) virsmas. Šo suspensiju iesēj Rū (Roux) kolbā, kas satur 250 ml barotnes (4.1.), kuras pH ir noregulēts uz 7,0. Inkubē 24 stundas 35oC temperatūrā, pēc tam savāc baktērijas 25 ml fizioloģiskā šķīduma (4.4.). Homogenizē un atšķaida šo suspensiju, lai iegūtu aptuveni 75 % gaismas caurlaidību pie 650 nm. Glabājot ledusskapī, šo suspensiju var izmantot vienu nedēļu.
3.3. Priekšmēģinājumos uz plāksnēm ar noteikšanas pamatbarotni (4.1.) nosaka uzsējamā materiāla daudzumu, kas dažādām izmantojamā tilozīna koncentrācijām dod iespējami lielākās inhibēšanas zonas, kas vēl ir skaidras. Barotnes inokulēšanu veic 48 – 50oC temperatūrā.
4. Barotne un reaģenti
4.1. Noteikšanas pamatbarotne 1:
1 g glikoze;
10 g triptiskais peptons;
1,5 g gaļas ekstrakts;
3 g rauga ekstrakts;
10 – 20 g agars – atkarībā no kvalitātes;
destilēts ūdens līdz 1000 ml.
Tieši pirms lietošanas, kultūras uzturēšanai un baktēriju suspensijas pagatavošanai, noregulē pH uz 7,0, bet noteikšanai pH noregulē uz 8,0.
4.2. Fosfāta buferšķīdums, pH 8:
0,523 g kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4 – analītiski kvalitatīvs;
16,730 g kālija hidrogēnfosfāts K2HPO4 – analītiski kvalitatīvs;
destilēts ūdens līdz 1000 ml.
4.3. Fosfāta buferšķīdums, pH 7:
5,5 g kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4 – analītiski kvalitatīvs;
13,6 g kālija hidrogēnfosfāts K2HPO4 – analītiski kvalitatīvs;
destilēts ūdens līdz 1000 ml.
4.4. Sterils fizioloģiskais šķīdums
4.5. Tīrs metilspirts
4.6. 40 % (V/V) metilspirts
4.7. Fosfāta buferšķīduma (4.2.) maisījums ar tīru metilspirtu – tilpumu attiecībā 60:40
4.8. Standartviela: zināmas aktivitātes tilozīns
5. Standartšķīdumi
5.1. Standartvielu (4.8.) 3 stundas žāvē vakuumā (5 mm dzīvsudraba staba) žāvēšanas skapī 60oC temperatūrā. Iesver mērkolbā 10 – 50 mg, izšķīdina 5 ml metilspirta (4.5.) un šķīdumu atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu pH 7,0 (4.3.), lai iegūtu tilozīna bāzes koncentrāciju 1000 µg/ml.
5.2. No šā izejas šķīduma, atšķaidot ar maisījumu (4.7.), pagatavo standarta darba šķīdumu S8, kas satur 2 µg/ml tilozīna bāzes.
5.3. Pēc tam secīgu atšķaidīšanu gaitā (1 +1), izmantojot maisījumu (4.7.), pagatavo šādas koncentrācijas: S4 1 µg/ml, S2 0,5 µg/ml un S1 0,25 µg/ml.
6. Ekstrahēšana
6.1. Koncentrātiem ņem 10 g analizējamā parauga. Premiksiem un barībai ņem 20 g analizējamā parauga. Pievieno 60 ml fosfāta buferšķīdumu pH 8 (4.2.), kas iepriekš uzkarsēts līdz 80oC, un homogenizē 2 minūtes (ar mājsaimniecības mikseri, Ultra Turrax utt.).
6.2. Atstāj nostāvēties 10 minūtes, pievieno 40 ml metilspirta (4.5.) un homogenizē 5 minūtes. Centrifugē ekstraktu, alikvotu daļu atšķaida ar maisījumu (4.7.), lai iegūtu paredzamo tilozīna koncentrāciju 2 µg/ml (= U8). Pēc tam secīgu atšķaidīšanu gaitā (1 +1), izmantojot šķīdumu (4.7.), pagatavo koncentrācijas U4, U2 un U1.
6.3. Ja saturs ir mazāks par 10 ppm, rotācijas ietvaicētājā 35oC temperatūrā iztvaicē ekstraktu sausu un atlikumu izšķīdina 40 % metilspirtā (4.6.).
7. Noteikšanas metode
7.1. Inokulēšana barotnē
Noteikšanas pamatbarotnes (4.1.) pH noregulē uz 8,0 un 48 – 50oC temperatūrā inokulē ar baktēriju suspensiju (3.2.).
7.2. Paplāšu sagatavošana
7.2.1. Difūziju agarā izdara platēs, izmantojot 4 standartšķīduma koncentrācijas ( S8, S4, S2, S1 ) un 4 ekstrakta koncentrācijas ( U8, U4, U2, U1). Četras ekstrakta un standartšķīduma koncentrācijas ir jāievieto katrā platē.
7.2.2. Tādēļ izvēlas plates, kas ir pietiekami lielas, lai tajās agara barotnē varētu izveidot vismaz 8 iedobumus ar 10 – 13 mm diametru. Aprēķina inokulētās barotnes (7.1.) daudzumu, kas vajadzīgs, lai nodrošinātu viendabīgu aptuveni 2 mm biezu pārklājumu. Analīzi vēlams izdarīt uz platēm, kas sastāv no plakana stikla plāksnēm, kas aprīkotas ar pilnīgi horizontālu alumīnija vai plastmasas gredzenu, kuram ir 200 mm diametrs un 20 mm augstums.
7.2.3. Dobumos ar pipeti pārnes antibiotikas šķīduma precīzi nomērītus daudzumus starp 0,10 ml un 0,15 ml, atkarībā no dobumu diametra.
7.2.4. Katram paraugam difūziju atkārto vismaz 4 reizes ar katru koncentrāciju un tā, lai katra noteikšana ietvertu 32 inhibēšanas zonu novērtējumu.
7.3. Inkubācija
Plates inkubē vienu nakti 35 – 37oC temperatūrā.
8. Novērtēšana
8.1. Izmēra inhibēšanas zonu diametru, vēlams ar projicēšanu. Reģistrē mērījumus uz puslogaritmiskā papīra, atliekot koncentrācijas logaritmu pret kavēšanas zonu diametru. Uzzīmē standartšķīduma un ekstrakta kalibrēšanas līnijas. Ar nosacījumu, ka nenotiek traucēšana, abas līnijas ir paralēlas.
8.2. Relatīvās aktivitātes logaritmu aprēķina, izmantojot šādu formulu:
(U1 +
U2 + U4 +
U8 – S1 –
S2 – S4 –
S8) · 0,602
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
U4 + U8 +
S4 + S8 – U1 –
U2 – S1 –
S2
8.3. Faktiskā aktivitāte = paredzamā aktivitāte x relatīvā aktivitāte.
9. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10% pēc relatīvā lieluma.
Zemkopības ministrs M.Roze
25.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Virginiamicīna noteikšana ar difūzijas metodi agara barotnē
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka virginiamicīna saturu barībā un premiksos. Zemākā noteikšanas robeža ir 2 mg/kg (2 ppm)5.
2. Princips
Paraugu ekstrahē ar “Tween 80” metanola šķīdumā. Pēc centrifugēšanas vai filtrēšanas ekstraktu atšķaida un tā antibiotisko aktivitāti nosaka, izmērot virginiamicīna difūziju agara barotnē, kurā iesēta Micrococcus luteus kultūra. Par difūziju liecina inhibēšanas zonu veidošanās mikroorganisma klātbūtnē. Šo zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotiku koncentrācijas logaritmam izmantotajā antibiotiku koncentrāciju diapazonā.
3. Mikroorganisms: Micrococcus luteus ATCC nr. 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)
3.1. Kultūras uzturēšana
Mēģeni ar slīpagaru (4.1.), uz kura uzsēts Micrococcus luteus, inkubē 24 stundas aptuveni 30oC temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī aptuveni 40C temperatūrā un slīpagaru pārsēj reizi 14 dienās.
3.2. Baktēriju suspensijas pagatavošana 6
Ar aptuveni 2 – 3 ml nātrija hlorīda šķīduma (4.3.) noskalo kultūras augumu no slīpagara (3.1.) virsmas. Šo suspensiju iesēj Rū (Roux) kolbā, kas satur 250 ml barotnes (4.1.). Inkubē 18 – 20 stundas pie 30oC, pēc tam baktērijas savāc ar 25 ml nātrija hlorīda šķīdumu (4.3.). Samaisa un atšķaida šo suspensiju ar nātrija hlorīda šķīdumu (4.3.) tilpumu attiecībā 1:10, lai iegūtu aptuveni 75 % gaismas caurlaidību pie 650 nm, mērot 1 cm kivetēs pret nātrija hlorīda šķīdumu (4.3.). Glabājot ledusskapī aptuveni 4°C temperatūrā, šo suspensiju var izmantot vienu nedēļu.
4. Barotne un reaģenti
4.1. Pamatbarotne noteikšanai 1:
6,0 g gaļas peptons,
4,0 g triptons;
1 g glikoze;
1,5 g gaļas ekstrakts;
3 g rauga ekstrakts;
10 – 20 g agars – atkarībā no kvalitātes;
ūdens līdz 1000 ml.
pH 6,5 (pēc sterilizēšanas)
4.2. Fosfāta buferšķīdums, pH 6:
8,0 g kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4;
2,0 g kālija hidrogēnfosfāts K2HPO4;
ūdens līdz 1000 ml.
4.3. 0,8 % (m/V) nātrija hlorīda šķīdums
Izšķīdina 8 g nātrija hlorīda ūdenī un atšķaida ar ūdeni līdz 1000 ml.
4.4. Metilspirts
4.5. Fosfāta buferšķīduma (4.2.) maisījums ar metilspirtu tilpumu attiecībā 80/20
4.6. 0,5 % ( m/V) “Tween 80” šķīdums metilspirtā
Izšķīdina 5 g “Tween 80” metilspirtā (4.4.) un atšķaida ar metilspirtu līdz 1000 ml.
4.7. Standartviela: zināmas aktivitātes virginiamicīns
5. Standartšķīdumi
Pagatavo standartvielas (4.7.) šķīdumu metilspirtā, kas satur 1000 µg/ml virginiamicīna. Ja glabā slēgtā kolbā 40 C temperatūrā, šis šķīdums ir stabils 5 dienas. No šā izejas šķīduma, atšķaidot ar maisījumu (4.5.), pagatavo šādas koncentrācijas: S8 1,0 µg/ml, S4 0,5 µg/ml, S2 0,25 µg/ml un S1 0,125 µg/ml.
6. Ekstrakta un noteikšanas šķīdumu pagatavošana
6.1. Ekstrahēšana:
6.1.1. Produkti, kuros virginiamicīna saturs ir līdz 100 mg/kg;
Ņem 50 g analizējamā parauga, pievieno 200 ml šķīduma (4.6.) un krata 30 minūtes ar kratītāju. Centrifugē vai nostādina, ņem 20 ml dzidrā šķīduma un rotācijas ietvaicētājā temperatūrā, kas ir zemāka par 400C, iztvaicē līdz aptuveni 5 ml. Atlikumu izšķīdina maisījumā (4.5.), lai iegūtu paredzamo virginiamicīna koncentrāciju 1 µg/ml (= U8).
6.1.2. Produkti, kuros virginiamicīna saturs ir lielāks par 100 mg/kg.
Ņem ne vairāk kā 10 g analizējamā parauga, kas satur no 1 mg līdz 50 mg virginiamicīna, pievieno 100 ml šķīduma (4.6.) un krata 30 minūtes ar kratītāju. Centrifugē vai nostādina, pēc tam dzidro šķīdumu atšķaida ar maisījumu (4.5.), lai iegūtu paredzamo virginiamicīna koncentrāciju 1 µg/ml ( = U8).
6.2. Noteikšanas šķīdumi
No šķīduma U8 secīgu atšķaidīšanu gaitā (1+1), izmantojot maisījumu (4.5.), pagatavo šķīdumu U4 (paredzamais saturs 0,5 µg/ml), U2 (paredzamais saturs 0,25 µg/ml) un U1 (paredzamais saturs 0,125 µg/ml).
7. Noteikšanas metode
7.1. Inokulēšana barotnē
7.1.1. Baktēriju suspensiju (3.2.) inokulē pamatbarotnē (4.1.) aptuveni 50 – 60oC temperatūrā.
7.1.2. Priekšmēģinājumos uz platēm ar barotni (4.1.) nosaka baktēriju suspensijas daudzumu, kas rada lielākās un skaidrākās inhibēšanas zonas ar dažādām virginiamicīna koncentrācijām.
7.2. Paplāšu sagatavošana
7.2.1. Difūziju agarā izdara platēs, izmantojot 4 standartšķīduma koncentrācijas (S8, S4, S2, S1) un 4 ekstrakta koncentrācijas (U8, U4, U2, U1). Četras ekstrakta un standartšķīduma koncentrācijas ir jāievieto katrā platē.
7.2.2. Tādēļ izvēlas plates, kas ir pietiekami lielas, lai agara vidē varētu izveidot vismaz 8 dobumus ar diametru 10 – 13 mm un ne mazāk par 30 mm starp agarā izveidotajiem centriem. Analīzi var izdarīt uz platēm, kas sastāv no plakana stikla plāksnēm, kuras aprīkotas ar pilnīgi horizontālu alumīnija vai plastmasas gredzenu ar 200 mm diametru un 20 mm augstumu.
7.2.3. Platēs ielej barotni (4.1.), kas inokulēta, kā aprakstīts punktā 7.1., lai iegūtu aptuveni 2 mm biezu slāni (60 ml platēm ar diametru 200 mm). Ļauj sastingt horizontālā stāvoklī un izveido dobumus.
7.2.4. Dobumos ar pipeti iepilina precīzi nomērītus noteikšanas un standartšķīduma daudzumus starp 0,10 ml un 0,15 ml atkarībā no dobumu diametra.
7.2.5. Katram paraugam difūziju atkārto vismaz 4 reizes ar katru koncentrāciju tā, lai katra noteikšana ietvertu 32 inhibēšanas zonu novērtējumu.
7.3. Inkubācija
Plates inkubē 16 līdz 18 stundas (30 ± 2)oC temperatūrā.
8. Novērtēšana
8.1. Ar 0,1 mm precizitāti izmēra inhibēšanas zonu diametru. Katrai koncentrācijai atbilstīgo vidējo mērījumu atzīmē uz puslogaritmiskā papīra, parādot koncentrāciju logaritmu attiecībā pret inhibēšanas zonu diametriem. Uzzīmē “atbilstošākās” līnijas attiecīgi standartšķīdumam un ekstraktam, piemēram, šādi:
8.1.1. Nosaka “atbilstošāko” punktu standarta zemākajam līmenim (SL) pēc formulas:
7S1 + 4S2 +
S4 – 2S8
a) SL = ––––––––––––––––––
10
8.1.2. Nosaka “atbilstošāko” punktu standarta augstākajam līmenim (SH) pēc formulas:
7S8 + 4S4 +
S2 – 2S1
b) SH = ––––––––––––––––––
10
8.2. Līdzīgi aprēķina “atbilstošākos” punktus ekstrakta zemākajam koncentrācijas līmenim (UL) un augstākajam līmenim (UH), norādītajās formulās S1, S2, S4 un S8 aizstājot attiecīgi ar U1, U2, U4 un U8.
8.3. Uz tā paša puslogaritmiskā papīra atzīmē aprēķinātos SL un SH lielumus, un, tos savienojot, iegūst “atbilstošāko” līniju standartšķīdumam. Līdzīgi atzīmē UH un UL, kurus savieno un iegūst “atbilstošāko” līniju ekstraktam.
8.4. Ja nav nekādu traucējošu faktoru, abām līnijām jābūt paralēlām. Praktiskos nolūkos līnijas var uzskatīt par paralēlām, ja (SH–SL) un (UH–UL) vērtības neatšķiras vairāk par 10 % no to vidējā lieluma.
8.5. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, var atmest U1 un S1 vai U8 un S8, un SL, SH, UL un UH aprēķināt pēc alternatīvām formulām, iegūstot alternatīvas “atbilstošākās” līnijas:
5S1 + 2S2 –
S4
5S2 + 2S4 –
S8
a') SL = ––––––––––––– vai SL = –––––––––––
6
6
5S4 + 2S2 –
S1
5S8 + 2S4 –
S2
b') SH = ––––––––––––– vai SH = –––––––––––
6
6
8.6. Alternatīvo “atbilstošāko” līniju paralelitāte jāpārbauda tāpat kā iepriekš. Ja rezultāti aprēķināti pēc trim līmeņiem, tas būtu jānorāda beigu ziņojumā.
8.7. Ja līnijas uzskata par paralēlām, aprēķina relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) pēc vienas no formulām atkarībā no tā, vai trīs vai četri koncentrāciju līmeņi tika izmantoti paralelitātes novērtēšanai:
8.7.1. Pēc četriem līmeņiem
(U1 + U2 +
U4 + U8 –
S1 – S2 –
S4 – S8) x 0.602
c) log A = –––––––––––––––––––––––––––––––––
U4 + U8 +
S4 + S8 – U1 –
U2 – S1 –
S2
8.7.2. Pēc trim līmeņiem
(U1 + U2 +
U4 – S1 –
S2 – S4) x 0.401
d) log A = –––––––––––––––––––––––––––––
U4 + S4 + S8 –
U1 – S1
vai
(U2 + U4 +
U8 – S2 –
S4 – S8) x 0.401
d') log A = –––––––––––––––––––––––––––––
U8 + S8 –
U2 – S2
8.8. Parauga ekstrakta aktivitāte = atbilstošā standarta aktivitāte x A.
(U8 = S8 x A)
8.9. Ja relatīvā aktivitāte neiekļaujas intervālā no 0,5 līdz 2,0, noteikšanu atkārto, attiecīgi koriģējot ekstrakta koncentrācijas, vai, ja tas nav iespējams, koriģējot standartšķīdumu koncentrācijas. Ja relatīvo aktivitāti nevar iekļaut vajadzīgajās robežās, jebkurš iegūtais rezultāts jāuzskata par aptuvenu un tas jānorāda beigu ziņojumā.
8.10. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, noteikšanu atkārto. Ja paralelitāti tomēr nepanāk, noteikšana jāuzskata par neapmierinošu.
8.11. Rezultātu izsaka virginiamicīna miligramos uz barības kilogramu.
9. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
9.1. 2 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja virginiamicīna saturs ir ir līdz 10 mg/kg;
9.2. 20 % no lielākā rezultāta, ja virginiamicīna saturs ir no 10 līdz 25 mg/kg;
9.3. 5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja virginiamicīna saturs ir no 25 līdz 50 mg/kg;
9.4. 10 % no lielākā rezultāta, ja saturs pārsniedz 50 mg/kg.
1 Var izmantot jebkuru tirdzniecībā esošu līdzīga sastāva barotni, kas dod tādus pašus rezultātus.
2 Amīdmelno izmanto, lai padarītu redzamas standartšķīdumu kavēšanas zonas (zili gredzeni).
3 Šis klons, ko izolējusi LUFA Ķīlē, aug ātrāk nekā S. aureus ATCC 6538 P
4 Klonu izolējusi LUFA Ķīlē
5 1 mg virginiamicīna atbilst 1000 UK vienībām
6 Var izmantot citas metodes, kas dod līdzīgu baktēriju suspensiju
Zemkopības ministrs M.Roze
26.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Mitruma satura noteikšana dzīvnieku un augu izcelsmes taukos un eļļās
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka ūdens un gaistošo vielu saturu dzīvnieku un augu taukos un eļļās.
2. Princips
Paraugu žāvē līdz nemainīgam svaram 1030C temperatūrā. Masas zudumu nosaka sverot.
3. Iekārtas
3.1. Plakandibena nerūsējoša materiāla trauks ar diametru 8 – 9 cm un 3 cm augsts
3.2. Apmēram 10 cm garš dzīvsudraba termometrs ar izplešanās cauruli tā augšgalā – graduēts no 800C līdz 1100C
3.3. Smilšu vanna vai elektriskā plītiņa
3.4. Eksikators ar efektīvu žāvēšanas aģentu
3.5. Analītiskie svari
4. Darba gaita
4.1. Sausā, nosvērtā traukā (3.1.), kurā ir ievietots termometrs (3.2.), iesver apmēram 20g homogenizēta parauga ar precizitāti līdz mg. Smilšu vannā vai uz elektriskās plītiņas (3.3.), pastāvīgi maisot ar termometru, paraugu silda tā, lai apmēram 7 minūtēs tā temperatūra paaugstinātos līdz 900C.
4.2. Sildīšanas intensitāti regulē atkarībā no tā, cik bieži no trauka dibena paceļas burbuļi. Temperatūra nedrīkst pārsniegt 1050C. Maisīšanu turpina gar trauka dibenu, līdz pārstāj veidoties burbuļi.
4.3. Lai pilnībā nodrošinātu mitruma izdalīšanos no parauga, temperatūru vairākas reizes paaugstina līdz 1030C ± 20C, starplaikos atdzesējot līdz 930C. Pēc tam eksikatorā (3.4.) atdzesē līdz istabas temperatūrai un nosver. Šo operāciju atkārto tikmēr, kamēr divu secīgu svērumu masas atšķirības nepārsniedz 2 mg.
Piezīme. Parauga masas palielināšanās pēc atkārtotas karsēšanas liecina par tauku oksidēšanos. Šādā gadījumā rezultātu aprēķina pēc svēruma, kas izdarīts, pirms sākusies masas palielināšanās.
5. Rezultātu aprēķināšana
5.1. Parauga mitruma saturu izsaka procentos un to aprēķina, izmantojot šādu formulu:
100
(M1 – M2) x –––––,
M0
kur
M0 – analizējamā parauga masa gramos
M1 – trauka un tā satura masa pirms svēršanas
M2 – trauka un tā satura kopējā masa pēc karsēšanas
5.2. Rezultāts, kas ir mazāks par 0,05 %, reģistrē kā “mazāks par 0,05 %”.
6. Atkārtojamība
Viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirības pēc absolūtā lieluma nedrīkst pārsniegt 0,05 %.
Zemkopības ministrs M.Roze
27.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Magnija noteikšana ar atomu absorbcijas spektrofotometriju
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka magnija saturu barības līdzekļos. Tā ir īpaši piemērota magnija noteikšanai, ja tā saturs paraugā nepārsniedz 5 %.
2. Princips
Paraugu pārpelno un izšķīdina atšķaidītā sālsskābē. Ja paraugā nav organisko vielu, to šķīdina atšķaidītā sālsskābē nepārpelnojot. Šķīdumu atšķaida un magnija saturu nosaka ar atomu absorbcijas spektrofotometru ar 285,2 nm filtru, izmantojot standartšķīdumus.
3. Reaģenti
3.1. Sālsskābe, tīra analīzei (a.t.) – d: 1.16;
3.2. Koncentrēta sālsskābe (a.t.) – d: 1.19;
3.3. Magnija lenta vai stieple, vai istabas temperatūrā izžāvēts magnija sulfāta heptahidrāts;
3.4. Stroncija sāls (hlorīds vai nitrāts) 2,5 % m/v šķīdums (= 76,08g SrC12·6H2O a.t. vai 60,38g Sr(NO3)2a.t.);
3.5. Magnija standartšķīdums: ņem 1g magnija (3.3.) ar precizitāti līdz mg, no kura iepriekš rūpīgi notīrīta oksīda kārtiņa, vai attiecīgu daudzumu (10,143 g) magnija sulfāta heptahidrāta (3.3.). Iesvaru pārnes uz 1000 ml mērkolbu, pievieno 80 ml sālsskābi (3.1.), izšķīdina un uzpilda līdz 1000 ml ar ūdeni. 1 ml iegūtā šķīduma satur 1.000 mg magnija.
4. Iekārtas
4.1. Platīna, kvarca vai porcelāna tīģeļi;
4.2. Elektriskā mufeļkrāsns ar termostatu;
4.3. Atomu absorbcijas spektrofotometrs.
5. Darba gaita
5.1. Parauga šķīduma sagatavošana:
5.1.1. Tikai minerālvielas saturoši barības līdzekļi;
Ņem 5 g parauga ar precizitāti līdz mg, ko ar 250 līdz 300 ml ūdens pārnes uz 500 ml mērkolbu. Pievieno 40 ml sālsskābes (3.1.), uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai un 30 minūtes vāra uz lēnas uguns. Ļauj atdzist, uzpilda līdz atzīmei ar ūdeni, samaisa un filtrē caur sausu kroku filtru sausā vārglāzē. Filtrāta pirmos 30 ml izlej. Ja paraugā ir silīcija dioksīds, 5g parauga apstrādā ar pietiekamu daudzumu (15–30 ml) sālsskābes (3.2.), uz ūdens vannas paraugu iztvaicē sausu un uz vienu stundu ievieto žāvēšanas skapī 105°C temperatūrā. Tālāk rīkojas, kā aprakstīts 5.1.2. punktā, sākot ar trešo teikumu.
5.1.2. Barības līdzekļi, kas galvenokārt sastāv no minerālvielām;
Tīģelī iesver 5 g parauga ar precizitāti līdz mg, to pārpelno mufeļkrāsnī pie 5500C, līdz pelnos nav ogles daļiņu, un ļauj atdzist. Silīcija dioksīda atdalīšanai pelnus apstrādā ar pietiekamu daudzumu (15–30 ml) sālsskābes (3.2.), uz ūdens vannas iztvaicē sausu un uz vienu stundu ievieto žāvējamā skapī 1050C temperatūrā. Atlikumu izšķīdina 10 ml sālsskābes (3.1.) un ar siltu ūdeni pārnes uz 500 ml mērkolbu. Šķīdumu atdzesē un uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei. Samaisa un filtrē sausā mērglāzē caur sausu kroku filtru. Izlej pirmos 30 ml filtrāta.
5.1.3. Barības līdzekļi, kuru galvenās sastāvdaļas ir organiskās vielas.
Tīģelī iesver 5g parauga ar precizitāti līdz mg, to pārpelno mufeļkrāsnī pie 5500C, līdz pelnos nav ogles daļiņu. Pelnus izšķīdina 5 ml sālsskābes (3.2.), šķīdumu uz ūdens vannas iztvaicē sausu un silīcija dioksīda pārvēršanai nešķīstošā formā vienu stundu žāvē žāvējamā skapī 1050C temperatūrā. Pelnus izšķīdina 5 ml sālsskābes (3.1.), ar siltu ūdeni pārnes uz 250 ml mērkolbu, uzkarsē, līdz šķīdums sāk vārīties, ļauj atdzist un uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei. Samaisa un filtrē sausā mērglāzē caur sausu kroku filtru. Izlej pirmos 30 ml filtrāta.
5.2. Darba gaita
Atšķaidot standartšķīdumu (3.5.) ar ūdeni, pagatavo vismaz 5 kontrolšķīdumus ar pieaugošu koncentrāciju, kas atbilst spektrofotometra optimālajam mērīšanas diapazonam. Visiem šķīdumiem pievieno 10 ml stroncija sāls šķīduma (3.4.) un uzpilda ar ūdeni līdz 100 ml . Saskaņā ar 5.1.1., 5.1.2. vai 5.1.3. punktu iegūtā analīzei ņemtā filtrāta daļu atšķaida ar ūdeni tā, lai magnija koncentrācija iegūtajā šķīdumā būtu kontrolšķīdumu koncentrāciju robežās. Sālsskābes koncentrācija šajā šķīdumā nedrīkst pārsniegt 0,4n. Katram analizējamā parauga šķīdumam pievieno 10 ml stroncija sāls šķīduma (3.4.) un pēc tam uzpilda ar ūdeni līdz 100 ml. Analizējamā šķīduma un kontrolšķīdumu absorbciju mēra ar 285,2 nm filtru.
6. Rezultātu aprēķināšana
Magnija daudzumu paraugā aprēķina pēc kontrolšķīdumiem. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
7. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 5%.
Zemkopības ministrs M.Roze
28.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Kokšķiedras noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi barībā nosaka tādas skābēs un sārmos nešķīstošas organiskās vielas, kas nesatur taukus un ko parasti sauc par kokšķiedru.
2. Princips
Paraugu secīgi apstrādā ar noteiktas koncentrācijas verdošiem sērskābes un kālija hidroksīda šķīdumiem. Vajadzības gadījumā paraugu attauko. Atlikumu atdala, filtrējot caur stikla filtru, mazgā, žāvē, sver un pārpelno 450 – 500°C temperatūrā. Svara zudums pēc parauga pārpelnošanas atbilst analizējamā parauga kokšķiedras saturam.
3. Reaģenti
3.1. Sērskābe 0,26 mol/l
3.2. Putu dzēšanas līdzeklis (piemēram, n–oktanols)
3.3. Filtrējošais materiāls (Celite 545 vai līdzīgs) – četras stundas karsēts 5000C temperatūrā (8.6.apakšpunkts)
3.4. Acetons
3.5. Dietilēteris – frakcija 40 – 60
3.6. Sālsskābes šķīdums – c = 0,5 mol/l
3.7. Kālija hidroksīda šķīdums 0,23 mol/l
4. Iekārtas
4.1. Sildierīce apstrādei ar sērskābi vai kālija hidroksīdu, aprīkota ar paliktni filtra tīģelim (4.2.) un cauruli ar krānu šķidrumu aizvadīšanai un vakuuma nodrošināšanai. Pirms lietošanas filtrtīģeļus mazgā piecas minūtes ar verdošu ūdeni
4.2. Stikla filtra tīģelis ar iekausētu stikla filtru, kura poru lielums ir 40 – 90 µm. Pirms lietošanas tīģeļus uzkarsē 5000C temperatūrā un atdzesē (8.6. apakšpunkts)
4.3. 270 mm cilindri ar atteces dzesinātāju – ir piemēroti vārīšanai
4.4. Žāvēšanas krāsniņa ar termostatu
4.5. Elektriskā mufeļkrāsns ar termostatu
4.6. Ekstrakcijas iekārta, kas sastāv no paliktņa filtra tīģelim (4.2.) un šķīdrumu un vakuuma izvadcaurules ar krānu
4.7. Gredzeni (savienojumi), kas savieno sildierīci (4.1.), tīģeli (4.2.), cilindru (4.3.) un aukstās ekstrakcijas iekārtu (4.6.) ar tīģeli
5. Darba gaita
5.1. Nosver 1 g parauga ar precizitāti līdz 0,001 g un ievieto tīģelī (4.2.) (skatīt piezīmes 8.1., 8.2. un 8.3.apakšpunktā) un pievieno 1 g filtrējošo materiālu (3.3.).
5.2. Ņem sildierīci (4.1.) un filtra tīģeli (4.2.), pie tīģeļa pievieno cilindru (4.3.). 150 ml verdošas sērskābes (3.1.) ielej pievienotajā cilindrā un tīģelī. Ja nepieciešams, pievieno pāris pilienus putu dzēšanas līdzekļa (3.2.).
5.3. Šķidrumu uzvāra 5 ± 2 minūtēs un vāra precīzi 30 minūtes.
5.4. Atgriež krānu izejas caurulei (4.1.) un ar vakuumu caur filtra tīģeli izfiltrē sērskābi. Atlikumu izmazgā trīs reizes ar 30 ml verdoša ūdens, pārliecinoties, ka atlikums pēc katras mazgāšanas ir sauss.
5.5. Aizver izejas krānu un cilindrā ar tīģeli ielej 150 ml verdoša kālija hidroksīda šķīdumu. Pievieno pāris pilienus putu dzēšanas līdzekli (3.2.). 5 ± 2 minūtēs uzsilda šķidrumu līdz vārīšanās punktam un vāra precīzi 30 minūtes. Izfiltrē un atkārto sērskābes mazgāšanas procedūru.
5.6. Pēc pēdējās mazgāšanas un izžāvēšanas atvieno tīģeli un tā saturu pievieno pie aukstās ekstrakcijas iekārtas (4.6.). Izmantojot vakuumu, nogulsnes trīs reizes izmazgā ar 25 ml acetona (3.4.), pārliecinoties, ka pārpalikums pēc katras mazgāšanas ir sauss.
5.7. Žāvējamā krāsnī pie 1300C temperatūras izžāvē tīģeli līdz vienmērīgam svaram. Pēc katras žāvēšanas atdzesē to eksikatorā un nosver. Ievieto tīģeli mufeļkrāsnī un tā saturu pārpelno līdz pastāvīgam svaram 475 – 5000C temperatūrā apmēram 30 minūtes.
5.8. Pēc katras karsēšanas un pirms svēršanas vispirms tīģeli atdzesē krāsnī un pēc tam eksikatorā. Veic “tukšo” analīzi bez parauga. Svara zudums pārpelnošanas rezultātā nedrīkst pārsniegt 4 mg.
6. Rezultātu aprēķināšana
Parauga kokšķiedras saturu izsaka procentos un to aprēķina, izmantojot šādu formulu:
(b – c) x 100 ,
–––––––––
a
kur
a – analizējamā parauga masa g
b – parauga masas zudums pēc pārpelnošanas g
c – masas zudums pēc “tukšās” analīzes pārpelnošanas g
7. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
7.1. 0,3 % pēc absolūtā lieluma, ja kokšķiedras saturs ir mazāks par 10%
7.2. 3,0 % pēc relatīvā lieluma, ja kokšķiedras saturs ir 10% vai lielāks.
8. Piezīmes
8.1. Barības līdzekļi, kuros ir vairāk kā 10% eļļu un tauku, pirms analīzes jāattauko ar dietilēteri (3.5.). Šim nolūkam filtra tīģeli (4.2.) ar tā saturu pievieno aukstās ekstrakcijas iekārtai (4.6.). Paraugu trīs reizes pēc kārtas mazgā ar 30 ml ētera un ar vakuumu nofiltrē, pārliecinoties, vai pārpalikums ir sauss. Pievieno tīģeli un tā saturu pie sildierīces (4.1.) un turpina, kā aprakstīts 5.punktā.
8.2. Barības līdzekļus, kuri satur eļļas un taukus, kas nav tieši ekstrahējami ar ēteri (3.5.), attauko saskaņā ar 8.1.apakšpunktu un atkārtoti attauko pēc izvārīšanas skābē. Pēc parauga izvārīšanas skābē un tam sekojošas izmazgāšanas pievieno tīģeli aukstās ekstrakcijas iekārtai (4.6.). Nogulsnes mazgā trīs reizes ar 30 ml acetona, pēc tam trīs reizes mazgā ar 30 ml ētera. Ar vakuumu nofiltrē nogulsnes sausas un turpina analīzi, kā aprakstīts 5.punktā, sākot ar kālija hidroksīda apstrādi.
8.3. Ja barībā karbonātu saturs ir virs 5%, kas izteikti kā kalcija karbonāti, tad pievieno tīģeli (4.2.) ar nosvērto paraugu sildierīcei (4.1.). Paraugu mazgā trīs reizes ar 30 ml sālsskābes (3.6.). Pēc katras mazgāšanas un pirms katras filtrēšanas ļauj paraugam nostāvēties apmēram vienu minūti. Vēlreiz mazgā nogulsnes ar 30 ml ūdens un turpina analīzi, kā aprakstīts 5.punktā.
8.4. Ja iekārta nodrošina vairāku paraugu vienlaicīgu noteikšanu (sildierīcei ir pievienoti vairāki tīģeļi), tad vienam paraugam nedrīkst vienlaicīgi veikt paralēlās analīzes.
8.5. Ja pēc vārīšanas ir grūti nofiltrēt skābos un bāziskos šķīdumus, tad izmanto saspiestu gaisu, ko vada cauri sildierīces izejas caurulei, un tad turpina filtrēt.
8.6. Pārpelnošanas laikā temperatūra nedrīkst būt lielāka par 5000C, lai paildzinātu stikla filtra tīģeļa kalpošanas laiku. Ir jārūpējas, lai sildīšanas un atdzešēšanas laikā nebūtu ļoti strauju, lielu temperatūras izmaiņu.
Zemkopības ministrs M.Roze
29.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Aflatoksīna B1 noteikšana
1. Viendimensijas plānslāņu hromatogrāfijas metode
1.1. Mērķis un darbības sfēra
1.1.1. Ar šo metodi var noteikt aflatoksīna B1 saturu šādā barībā: zemesriekstos, koprā, linsēklās, sojā, sezamā, babasū palmā, kukurūzas dīgļu eļļas raušos, labībā un labības produktos, zirņu miltos, kartupeļu mīkstumā un kartupeļu cietē. Zemākā noteikšanas robeža ir 0,01 µg/kg (10 ppb).
1.1.2. Ja traucējošu vielu klātbūtne apgrūtina noteikšanu, analīze jāatkārto, izmantojot B metodi (divdimensiju plānslāņu hromatogrāfija).
1.2. Princips
Paraugu ekstrahē ar hloroformu. Ekstraktu izfiltrē, ņem alikvotu daļu un attīra kolonnas hromatogrāfijā ar silikagelu. Eluātu ietvaicē un atlikumu no jauna izšķīdina noteiktā daudzumā hloroforma vai benzola un acetonnitrila maisījuma. Alikvotu šā šķīduma daļu lieto plānslāņu hromatogrāfijā. Apstarojot hromatogrammu ar UV gaismu, aflatoksīna daudzumu nosaka vizuāli vai fluordensitometrijā, salīdzinot ar aflatoksīna B1 standartiem, kuros aflatoksīna daudzums ir zināms. No barības ekstrahētā aflatoksīna B1 identitāte jāapstiprina saskaņā ar norādīto procedūru.
1.3. Reaģenti
N.B. Ja nav citu norādījumu, visiem reaģentiem jābūt “analītiska reaģenta” kvalitātē.
1.3.1. Acetons
1.3.2. Hloroforms, kas stabilizēts ar 0,5–1,0 % 96 % etanola (V/V)
1.3.3. n–Heksāns
1.3.4. Metilspirts
1.3.5. Bezūdens dietilēteris, kas nesatur peroksīdus
1.3.6. Benzola un acetonitrila maisījums: 98/2 (V/V)
1.3.7. Hloroforma (1.3.2.) un metilspirta (1.3.4.) maisījums: 97/3 (V/V)
1.3.8. Silikagels, kolonnas hromatogrāfijai, daļiņu lielums 0,05 – 0,20 mm
1.3.9. Absorbējoša kokvilnas vate, kas iepriekš attaukota ar hloroformu, vai stikla vate
1.3.10. Granulēts bezūdens nātrija sulfāts
1.3.11. Inerta gāze, piemēram, slāpeklis
1.3.12. 1n sālsskābe
1.3.13. 50 % (V/V) sērskābe
1.3.14. Kizelgūrs (diatomīts), mazgāts skābē
1.3.15. Silikagels G–HR vai līdzvērtīgs – plānslāņa hromatogrāfijai
1.3.16. Standartšķīdums ar apmēram 0,1 µg aflatoksīna B1 uz ml hloroforma (1.3.2.) vai benzola/ acetonitrila maisījuma (1.3.6.), ko gatavo un pārbauda, kā norādīts 7. nodaļā
1.3.17. Kvalitatīvai pārbaudei paredzēts standartšķīdums, kas satur apmēram 0,1 µg aflatoksīna B1 un B2 uz ml hloroforma (1.3.2.) vai benzola/ acetonitrila maisījuma (3.6.). Šīs koncentrācijas ir orientējošas. Tās jānoregulē, lai abiem aflatoksīniem nodrošinātu vienādu fluorescences intensitāti
1.3.18. Kustīgā fāze:
1.3.18.1. Hloroforms (1.3.2.)/ acetons (1.3.1.): 9/1 (V/V), nepiesātināta kamera;
1.3.18.2. Dietilēteris (1.3.5.)/ metilspirts (1.3.4.)/ ūdens: 96/3/1 (V/V/V), nepiesātināta kamera;
1.3.18.3. Dietilēteris (1.3.5.)/ metilspirts (1.3.4.)/ ūdens: 94/4,5/1,5 (V/V/V), piesātināta kamera;
1.3.18.4. Hloroforms (1.3.2.)/ metilspirts (1.3.4.): 94/6 (V/V), piesātināta kamera;
1.3.18.5. Hloroforms (1.3.2.)/ metilspirts (1.3.4.): 97/3 (V/V), piesātināta kamera.
1.4. Aparatūra
1.4.1. Smalcinātājs – maisītājs
1.4.2. Kratītājs vai magnētiskais maisītājs
1.4.3. Kroku filtrpapīrs, Schleicher and Schuel nr. 588 vai līdzvērtīgi ar 24 cm diametru
1.4.4. Stikla caurule hromatogrāfijai, kuras iekšējais diametrs ir 22 mm un garums 300 mm, ar politetrafluoretilēna (PTFE) krānu un 250 ml rezervuāru
1.4.5. Rotācijas ietvaicētājs ar 500 ml apaļkolbu
1.4.6. 500 ml koniskās kolbas ar šlifa aizbāžņiem
1.4.7. Plānslāņa hromatogrāfijas iekārta
1.4.8. Stikla plates plānslāņu hromatogrāfijai, 200 x 200 mm, sagatavotas, kā norādīts tālāk tekstā (norādītie daudzumi ir pietiekami piecu plašu sagatavošanai). 30 g silikagela G–HR (1.3.15.) liek koniskā kolbā. Pievieno 60 ml ūdens, aiztaisa un krata vienu minūti. Suspensiju klāj uz platēm tā, lai izveidojas viendabīgs 0,25 mm slānis. Ļauj nožūt gaisā un tad glabā eksikatorā ar silikagelu. Pirms lietošanas plates aktivē, turot vienu stundu žāvēšanas skapī 110°C temperatūrā. Var izmantot gatavas plates, ja tās dod līdzīgus rezultātus tiem, ko iegūst ar platēm, kuras gatavo, kā aprakstīts iepriekš.
1.4.9. UV lampa ar lielu viļņu garumu (360 nm). Gaismas intensitātei jānodrošina 1 ng aflatoksīna B1 plankuma skaidra izšķiršana uz plānslāņu hromatogrāfijas plates 10 cm attālumā no lampas
1.4.10. Graduētas 10 ml mēģenes ar polietilēna aizbāžņiem
1.4.11. UV spektrofotometrs
1.4.12. Fluordensitometrs (vēlams)
1.5. Darba gaita
1.5.1. Parauga sagatavošana (skat. 3. daļas “Piezīmes” 3.1. punktā)
Samaļ paraugu tā, lai tas viss iet caur sietu ar 1 mm acu izmēru (saskaņā ar ISO R 565 ieteikumiem).
1.5.2. Ekstrakcija
50 g samalta un homogenizēta parauga liek koniskā 500 ml kolbā (1.4.6.). Pievieno 25 g kizelgūra (1.3.14.), 25 ml ūdens un 250 ml hloroforma (1.3.2.). Aiztaisa kolbu, krata vai maisa 30 minūtes ar aparātu (1.4.2.) un izfiltrē caur kroku filtrpapīru (1.4.3.). Izmet pirmos 10 ml filtrāta un savāc 50 ml.
1.5.3. Attīrīšana kolonnā
1.5.3.1. Hromatogrāfijas caurules (1.4.4.) apakšgalā ieliek kokvilnas vai stikla vates tamponu (1.3.9.), divas trešdaļas caurules piepilda ar hloroformu (1.3.2.) un pievieno 5 g nātrija sulfāta (1.3.10.).
1.5.3.2. Pārbauda, vai nātrija sulfāta slāņa augšējā virsma ir līdzena, un mazās porcijās pievieno 10 g silikagela (1.3.8.). Pēc katras porcijas pievienošanas uzmanīgi samaisa, lai izdalās gaisa burbuļi. Ļauj nostāties 15 minūtes un tad uzmanīgi pievieno 15 g nātrija sulfāta (1.3.10.). Ļauj šķidrumam tecēt uz leju, līdz tas ir nedaudz virs nātrija sulfāta slāņa augšējās virsmas.
1.5.3.3. Sajauc 50 ml ekstrakta, kas savākts, kā aprakstīts 1.5.2., ar 100 ml n–heksāna (1.3.3.), un maisījumu kvantitatīvi pārnes uz kolonnu. Ļauj šķidrumam tecēt uz leju, līdz tas ir nedaudz virs nātrija sulfāta slāņa augšējās virsmas. Iztekošo šķidrumu izlej. Tad pievieno 100 ml dietilētera (1.3.5.) un vēlreiz ļauj tecēt līdz nātrija sulfāta slāņa augšējai virsmai. Veicot šīs darbības, jāraugās, lai tecēšanas ātrums ir no 8 līdz 12 ml minūtē un lai kolonna neiztek sausa. Atmet iztekošo šķidrumu. Pēc tam eluē ar 150 ml hloroforma/ metilspirta maisījuma (1.3.7.) un savāc visu eluātu.
1.5.3.4. Pēdējo ar rotācijas ietvaicētāju (1.4.5.) gandrīz līdz sausam ietvaicē inertas gāzes (1.3.11.) plūsmā temperatūrā, kas nepārsniedz 50 °C. Atlikumu, izmantojot hloroforma (1.3.2.) vai benzola un acetonitrila maisījumu (1.3.6.), kvantitatīvi pārnes uz graduētu 10 ml mēģeni (1.4.10.). Šķīdumu koncentrē inertas gāzes (1.3.11.) plūsmā un pēc tam papildina tilpumu līdz 2 ml ar hloroformu (1.3.2.) vai benzola un acetonitrila maisījumu (1.3.6.).
1.5.4. Plānslāņu hromatogrāfija
1.5.4.1. Uz plānslāņu hromatogrāfijas plates (1.4.8.) 2 cm no apakšējās malas ar 2 cm atstarpēm uznes turpmāk norādītos standartšķīduma un ekstrakta tilpumus:
– 10, 15, 20, 30 un 40 µl aflatoksīna B1 standartšķīduma (1.3.16.):
– 10 µl ekstrakta, ko iegūst, kā aprakstīts 1.5.3. punktā, un uznes virsū tajā pašā vietā, 20 µl standartšķīduma (1.3.16.);
– 10 un 20 µl ekstrakta, ko iegūst, kā aprakstīts 1.5.3. punktā.
1.5.4.2. Hromatografēšanu veic tumsā ar vienu no kustīgajām fāzēm (1.3.18.). Kustīgās fāzes šķīdinātāji jāizvēlas iepriekš, liekot 25 µl kvalitatīvā standartšķīduma (1.3.17.) uz plates un pārbaudot, vai pēc hromatografēšanas aflatoksīns B1 ir pilnīgi atdalījies no B2.
1.5.4.3. Ļauj šķīdinātājiem iztvaikot tumsā un pēc tam apstaro ar UV gaismu, liekot plati 10 cm attālumā no lampas (1.4.9.). Aflatoksīna B1 plankumi fluorescē zili.
1.5.5. Kvantitatīva noteikšana:
Nosaka vizuāli vai fluordensitometrijā, kā norādīts turpmāk.
1.5.5.1. Vizuālie mērījumi;
Aflatoksīna B1 daudzumu ekstraktā nosaka, salīdzinot ekstrakta plankumu fluorescences intensitāti ar standartšķīduma plankumu fluorescences intensitāti. Vajadzības gadījumā interpolē. Fluorescencei, kas rodas, ekstraktu uzliekot uz standartšķīduma, jābūt intensīvākai par 10 µl ekstrakta fluorescenci un nedrīkst būt vairāk par vienu redzamu plankumu. Ja 10 µl ekstrakta fluorescence ir intensīvāka par 40 µl standartšķīduma fluorescenci, ekstraktu pirms atkārtotas plānslāņu hromatogrāfijas atšķaida 10 vai 100 reižu ar hloroformu (1.3.2.) vai benzola un acetonitrila maisījumu (1.3.6.).
1.5.5.2. Fluordensitometrijas mērījumi.
Aflatoksīna B1 plankumu fluorescences intensitāti mēra ar fluordensitometru (1.4.12.) 365 nm garuma ierosināšanas viļņos un 443 nm garuma emisijas viļņos. Aflatoksīna B1 daudzumu ekstrakta plankumos nosaka, salīdzinot to fluorescences intensitāti ar aflatoksīna B1 standarta plankumu fluorescences intensitāti.
1.5.6. Aflatoksīna B1 identitātes apstiprināšana:
Aflatoksīna B1 identitāti ekstraktā apstiprina turpmāk norādītajās procedūrās.
1.5.6.1. Apstrāde ar sērskābi;
Saskaņā ar 1.5.4. iegūto hromatogrammu apsmidzina ar sērskābi (1.3.13.). Aflatoksīna B1 plankumu zilajai fluorescencei jākļūst dzeltenai, apstarojot ar UV gaismu.
1.5.6.2. Divdimensiju hromatogrāfija ar aflatoksīna B1 pusacetāla (aflatoksīna B2a) veidošanos:
1.5.6.2.1. Šķīdumu lietojums;
Uz plates (1.4.8.) novelk divas taisnas līnijas, kas ir paralēlas divām blakusmalām (6 cm uz iekšu no katras malas), lai ierobežotu šķīdinātāja frontu pārvietošanos. Ar kapilārpipetēm vai mikrošļircēm uz plates uznes šādus šķīdumus:
– punktā A: tādu tilpumu attīrīta parauga ekstrakta, kas iegūts, kā aprakstīts 1.5.3. punktā, un satur apmēram 2,5 ng aflatoksīna B1;
– punktā B un C: 25 µl standartšķīduma (3.16.).
1.5.6.2.2. Hromatografēšana;
1.5.6.2.2.1. Hromatografē tumsā virzienā I ar kustīgo fāzi (1.3.18.1.) (1 cm slānis nepiesātinātā kamerā), līdz šķīdinātāju fronte sasniedz šķīdinātāja robežlīniju.
1.5.6.2.2.2. Izņem plati no kameras un piecas minūtes ļauj žūt tumsā apkārtējās vides temperatūrā. Tad 2,5 cm augstā joslā izsmidzina sālsskābi (1.3.12.), noklājot punktus A un B, kas 3. attēlā parādīti iezīmētajā rajonā, līdz tā kļūst tumša, bet plates atlikušo daļu aizsedz ar stikla plāksni. Ļauj reaģēt tumsā 10 minūtes, žāvē ar gaisa plūsmu apkārtējās vides temperatūrā.
1.5.6.2.2.3. Pēc tam hromatografē tumsā virzienā II ar kustīgo fāzi (1.3.18.1.) (1 cm slānis nepiesātinātā kamerā), līdz šķīdinātāju fronte sasniedz šķīdinātāja robežlīniju. Izņem plati no kameras un ļauj žūt apkārtējās vides temperatūrā.
1.5.6.2.3. Hromatogrammas interpretācija.
Hromatogrammu apskata UV gaismā (1.4.9.) un pārbauda, vai tai ir šādas iezīmes:
a) zils fluorescents aflatoksīna B1 plankums, kas radies no standartšķīduma C punktā (pārvietošanās virzienā I);
b) zils fluorescents nereaģējuša (ar sālsskābi) aflatoksīna B1 plankums un intensīvāk zils fluorescents aflatoksīna B1–pusacetāla plankums, kuri abi radušies no standartšķīduma punktā B (pārvietošanās virziens II);
c) plankumi, kas atbilst b) punktā aprakstītajiem, radušies no parauga ekstrakta punktā A. Šo plankumu atrašanās vietu nosaka, pirmkārt, aflatoksīna B1 pārvietošanās attālums no punkta A virzienā I (vienāds ar punktā C uznestā standarta pārvietošanās attālumu) un, otrkārt, aflatoksīna B1–pusacetāla pārvietošanās attālums no tā virzienā II (vienāds ar punktā B uznestā standarta pārvietošanās attālumu). To pusacetāla plankumu fluorescences intensitātei, kas radušies no ekstrakta un no standartšķīduma, kas uznests punktā B, būtu jāsakrīt.
1.6. Rezultātu aprēķināšana
1.6.1. Pēc vizuālajiem mērījumiem
Saturu mikrogramos aflatoksīna B1 uz kg parauga (ppb) aprēķina pēc formulas:
S · Y ·
V
–––––––,
W · X
kur:
Y un X ir attiecīgi aflatoksīna B1 standartšķīduma (1.3.16.) un ekstrakta ar līdzīgu fluorescences intensitāti tilpums mikrolitros;
S = koncentrācija mikrogramos aflatoksīna B1 uz ml standartšķīduma (1.3.16.);
V = ekstrakta galīgais tilpums mikrolitros, no kura var sagatavot jebkuru vajadzīgo atšķaidījumu;
W = parauga svars gramos, kas atbilst ekstrakta tilpumam, ko attīra kolonnā.
1.6.2. Pēc fluordensitometrijas mērījumiem.
Saturu mikrogramos aflatoksīna B1 uz kg parauga aprēķina pēc formulas:
S · V
–––––,
W · X
kur:
Y = uz plates uznestā ekstrakta tilpums mikrolitros (10 vai 20 µl);
S = aflatoksīna B1 daudzums nanogramos ekstrakta plankumā (proporcionāls attiecīgajai Y vērtībai), ko izsecina no mērījumiem;
V = ekstrakta galīgais tilpums mikrolitros, no kura var sagatavot jebkuru vajadzīgo atšķaidījumu;
W = parauga svars gramos, kas atbilst ekstrakta tilpumam, ko attīra kolonnā.
1.7. Standartšķīduma (3.16.) gatavošana un pārbaude
1.7.1. Aflatoksīna B1 koncentrācijas noteikšana
1.7.1.1. Sagatavo aflatoksīna B1 standartšķīdumu hloroformā (1.3.2.) vai benzola un acetonitrila maisījumā (1.3.6.) ar koncentrāciju no 8 līdz 10 µg/ml. Ar spektrofotometru (1.4.11.) nosaka absorbcijas spektru no 330 līdz 370 nm.
1.7.1.2. Izmēra optisko blīvumu (A) pie 363 nm līmenī hloroforma šķīdumā; vai pie 348 nm benzola un acetonitrila maisījuma šķīdumā.
1.7.1.3. Aprēķina aflatoksīna B1 koncentrāciju mikrogramos uz ml šķīduma pēc formulām:
312 · A ·
1000
––––––––––– hloroforma šķīdumā;
20600
312 · A ·
1000
––––––––––– benzola un acetonitrila
19800
maisījuma šķīdumā.
1.7.1.4. Pēc vajadzības, sargājot no dienasgaismas, atšķaida, lai iegūtu darba standartšķīdumu ar aflatoksīna B1 koncentrāciju apmēram 0,1 µg/ml. Glabājot ledusskapī 4 °C temperatūrā, šis šķīdums ir stabils divas nedēļas.
1.7.2. Hromatogrāfiskās tīrības pārbaude
Uzpilina uz plates (1.4.8.) 5 µl aflatoksīna B1 standartšķīduma, kas satur no 8 līdz 10 µg/ml (1.7.1.). Hromatogrammu attīsta, kā norādīts 1.5.4. punktā. UV gaismā hromatogrammā vajadzētu būt redzamam tikai vienam plankumam, un sākumpunktā nedrīkst būt uztverama fluorescence.
1.8. Atkārtojamība
No viena parauga viena analītiķa divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirība nedrīkst pārsniegt:
1.8.1. 25 % no lielākā rezultāta, ja aflatoksīna B1 saturs ir no 10 līdz 20 µg/kg;
1.8.2. 5 µg pēc absolūtā lieluma, ja saturs ir lielāks par 20 un mazāks par 50 µg/kg;
1.8.3. 10 % no lielākā rezultāta, ja saturs pārsniedz 50 µg/kg.
1.9. Atkārtojamība
Skatīt 3. daļas “Piezīmes” 2. punktā.
2. Divdimensiju plānslāņu hromatogrāfijas metode
2.1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka aflatoksīna B1 līmeni barībā, kura nav minēta A sadaļā. Zemākā noteikšanas robeža ir 0,01 µg/kg (10 ppb). Metode nav piemērojama barībai, kas satur citrusu augļu mīkstumu.
2.2. Princips
Paraugu ekstrahē ar hloroformu. Ekstraktu izfiltrē, ņem alikvotu daļu un attīra kolonnas hromatogrāfijā ar silikagelu. Eluātu ietvaicē un sauso atlikumu no jauna izšķīdina noteiktā daudzumā hloroforma vai benzola un acetonitrila maisījuma. Alikvotu šā šķīduma daļu lieto divdimensiju plānslāņu hromatogrāfijā. Apstarojot hromatogrammu ar UV gaismu, aflatoksīna B1 daudzumu nosaka vizuāli vai fluordensitometrijā, salīdzinot ar aflatoksīna B1 standartiem, kuros aflatoksīna daudzums ir zināms. No barības ekstrahētā aflatoksīna B1 identitāte jāapstiprina saskaņā ar norādīto procedūru.
2.3. Reaģenti
N.B. Ja nav citu norādījumu, visiem reaģentiem jābūt “analītiska reaģenta” kvalitātē.
2.3.1. Acetons
2.3.2. Hloroforms, kas stabilizēts ar 0,5–1,0 % 96 % etanolu (V/V)
2.3.3. n–Heksāns
2.3.4. Metilspirts
2.3.5. Bezūdens dietilēteris, kas nesatur peroksīdus
2.3.6. Benzola un acetonitrila maisījums – 98/2 (V/V)
2.3.7. Hloroforma (2.3.2.) un metilspirta (2.3.4.) maisījums – 97/3 (V/V)
2.3.8. Silikagels, kolonnas hromatogrāfijai, daļiņu lielums 0,05 – 0,20 mm
2.3.9. Absorbējoša kokvilnas vate, kas iepriekš attaukota ar hloroformu, vai stikla vate
2.3.10. Granulēts bezūdens nātrija sulfāts
2.3.11. Inerta gāze, piemēram, slāpeklis
2.3.12. 1 n sālsskābe
2.3.13. Kizelgūrs (diatomīts) – mazgāts skābē
2.3.14. Silikagels G–HR vai līdzvērtīgs – plānslāņa hromatogrāfijai
2.3.15. Kustīgā fāze
2.3.15.1. Dietilēteris (2.3.5.)/ metilspirts (2.3.4.)/ ūdens: 94/4,5/1,5 (V/V/V), piesātināta kamera
2.3.15.2. Hloroforms (2.3.2.)/ acetons (2.3.1.): 9/1 (V/V), nepiesātināta kamera
2.3.16. Standartšķīdums ar apmēram 0,1 µg aflatoksīna B1 uz ml hloroforma (3.2.) vai benzola un acetonitrila maisījuma (2.3.6.), ko gatavo un pārbauda, kā aprakstīts 1. metodes 1.7. punktā.
2.4. Aparatūra
Skatīt 1. metodes 1.4. punktā.
2.5. Procedūra
|
2.5.1. Parauga sagatavošana |
} |
Skatīt 1.metodes 1.5.1., 1.5.2. un 1.5.3. apakšpunktu |
|
2.5.2. Ekstrakcija |
||
|
2.5.3. Kolonnas tīrīšana |
2.5.4. Divdimensiju plānslāņa hromatogrāfija:
2.5.4.1. Šķīdumu lietojums;
2.5.4.1.1. uz plates (2.4.8.) novelk divas taisnas līnijas, kas ir paralēlas divām blakusmalām (attiecīgi 5 un 6 cm uz iekšu no katras mala), lai ierobežotu šķīdinātāja frontu pārvietošanos. Ar kapilārpipetēm vai mikrošļircēm uz plates uznes šādus šķīdumus:
– punktā A: 20 µl attīrīta parauga ekstrakta, ko iegūst saskaņā ar 2.5.3. punktu;
– punktā B: 20 µl standartšķīduma (2.3.16.);
– punktā C: 10 µl standartšķīduma (2.3.16.);
– punktā D: 20 µl standartšķīduma (2.3.16.);
– punktā E: 40 µl standartšķīduma (2.3.16.).
2.5.4.1.2. žāvē lēnā gaisa vai inertas gāzes (2.3.11.) plūsmā. Iegūto plankumu diametram jābūt apmēram 5 mm.
2.5.4.2. Hromatografēšana;
2.5.4.2.1. Hromatografē tumsā virzienā I ar kustīgo fāzi (2.3.15.1.) (1 cm slānis piesātinātā kamerā), līdz šķīdinātāju fronte sasniedz šķīdinātāja robežlīniju. Izņem plati no kameras un 15 minūtes ļauj žūt tumsā apkārtējās vides temperatūrā.
2.5.4.2.2. Pēc tam hromatografē tumsā virzienā II ar kustīgo fāzi (2.3.15.2.) (1 cm slānis nepiesātinātā kamerā), līdz šķīdinātāju fronte sasniedz šķīdinātāja robežlīniju. Izņem plati no kameras un ļauj žūt apkārtējās vides temperatūrā.
2.5.4.3. Homatogrammas interpretācija;
Apstaro hromatogrammu ar UV gaismu, noliekot plati 10 cm attālumā no lampas (2.4.9.). Atzīmē zilo fluorescento aflatoksīna B1 plankumu B,C, D un E novietojumu. Caur šiem plankumiem taisnā leņķī pret hromatografēšanas virzieniem projicē divas iedomātas taisnes. Šo līniju krustpunktā P ir prognozējams aflatoksīna B1 plankums, kas radies no punktā A uznestā parauga ekstrakta. Tomēr faktiski aflatoksīna B1 plankums var būt punktā Q, kur krustojas divas iedomātas taisnes, kas ir apmēram 100° leņķī viena pret otru un attiecīgi projicētas caur plankumu B un C. Aflatoksīna B1 daudzumu parauga ekstraktā nosaka, kā aprakstīts 2.5.5. punktā.
2.5.4.4. Papildhromatogrāfija.
Uz jaunas plates (2.4.8.) novelk divas taisnas līnijas, kas ir paralēlas divām blakusmalām, kā parādīts diagrammā 1. attēlā, un punktā A (skat. 1. attēlu) uznes 20 µl attīrītā ekstrakta, kas iegūts, kā aprakstīts 2.5.3. punktā, un uznes tam virsū 20 µl standartšķīduma (2.3.16.). Hromatografē, kā norādīts 5.4.2. punktā. Hromatogrammu apstaro ar UV gaismu (2.4.9.) un pārbauda, vai:
– aflatoksīna B1 plankumi, kas radušies no ekstrakta un standarta, ir viens otram virsū,
– šis plankums fluorescē intensīvāk nekā aflatoksīna B1 plankums punktā Q uz pirmās plates.
2.5.5. Kvantitatīva noteikšana:
Nosaka vizuāli vai fluordensitometrijā, kā norādīts tālāk tekstā.
2.5.5.1. Vizuāli mērījumi;
Aflatoksīna B1 daudzumu ekstraktā nosaka, salīdzinot ekstrakta plankuma fluorescences intensitāti ar standartšķīduma plankumu C, D un E fluorescences intensitāti. Vajadzības gadījumā interpolē. Ja 20 µl ekstrakta fluorescence ir intensīvāka par 40 µl standartšķīduma fluorescenci, ekstraktu pirms atkārtotas plānslāņa hromatogrāfijas atšķaida 10 vai 100 reižu ar hloroformu (2.3.2.) vai benzola un acetonitrila maisījumu (2.3.6.).
2.5.5.2. Fluordensitometrijas mērījumi.
2.5.5.2.1. Aflatoksīna B1 plankumu fluorescences intensitāti mēra ar fluordensitometru (2.4.12.) 365 nm garuma ierosināšanas viļņos un 443 nm garuma emisijas viļņos.
2.5.5.2.2. Aflatoksīna B1 daudzumu ekstrakta plankumā nosaka, salīdzinot ekstrakta plankuma fluorescences intensitāti ar standartšķīduma plankumu C, D un E fluorescences intensitāti.
2.5.6. Aflatoksīna B1 identitātes apstiprināšana
Skatīt 1. metodes 1.5.6. apakšpunktu.
2.6. Rezultātu aprēķināšana
Skatīt 1. metodes 1.6.punktu.
2.7. Atkārtojamība
Skatīt 1. metodes 1.8.punktu.
2.8. Atkārtojamība
Skatīt 3.daļas “Piezīmes” 3.2.punktu.
3. Piezīmes par 1. un 2. metodi
3.1. Attaukošana
3.1.1. Ja paraugi satur vairāk par 5 % tauku, tad pēc paraugu sagatavošanas, kas aprakstīta 1.5.1.apakšpunktā, jāattauko ar petrolēteri (v.t. 40 – 60 °C).
3.1.2. Tādos gadījumos analītiskie rezultāti jāizsaka neattaukotā parauga svara izteiksmē.
3.2. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
3.2.1. ± 50 % no vidējā lieluma, ja vidējais aflatoksīna B1 saturs ir no 10 līdz 20 µg/kg;
3.2.2. ± 10 µg/kg no vidējā lieluma, ja vidējais saturs pārsniedz 20 un ir mazāks par 50 µg/kg;
3.2.3. ± 20 % no vidējā lieluma, ja vidējais saturs pārsniedz 50 µg/kg.
Zemkopības ministrs M.Roze
30.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Cinka bacitracīna noteikšana ar difūzijas metodi agara barotnē
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka cinka bacitracīnu barībā un premiksos. Zemākā noteikšanas robeža ir 5 mg/kg (5 ppm)1.
2. Princips
Paraugu ekstrahē ar metanola, ūdens un sālsskābes maisījumu (pH 2) un nātrija sulfīda šķīdumu. Nātrija sulfīdu pievieno, lai izgulsnētu šķīstošos vara sāļus, kas varētu traucēt noteikšanu. Ekstraktu noregulē līdz pH 6,75, vajadzības gadījumā koncentrē un atšķaida. Tā antibiotisko aktivitāti novērtē, nosakot cinka bacitracīna difūziju agara barotnē, kas uzsēta ar Micrococcus luteus (sin. M. flavus). Difūziju nosaka pēc mikroorganisma kavējuma zonu veidošanās. Pieņem, ka minēto zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotiku koncentrācijas logaritmam izmantoto antibiotiku koncentrāciju intervālā.
3. Mikroorganisms: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240
3.1 Darba kultūras uzturēšana
Uz slīpagara barotnes (4.1.) uzsēj Micrococcus luteus (flavus). Inkubē 24 stundas 30°C temperatūrā, glabā ledusskapī apmēram 4°C temperatūrā un reizi divās nedēļās atkārtoti uzsēj uz slīpagara barotnes.
3.2. Baktēriju suspensijas pagatavošana a
Ar 2 – 3 ml nātrija hlorīda šķīduma (4.3.) noskalo augumu no nesen sagatavota slīpagara (3.1.). Iegūto suspensiju inokulē 250 ml barotnē (4.1.) Rū kolbā un inkubē 18 līdz 20 stundas 30°C temperatūrā. Augumu noņem ar 25 ml nātrija hlorīda šķīduma (4.3.) un samaisa. Suspensiju atšķaida ar nātrija hlorīda šķīdumu (4.3.) attiecībā 1:10. Suspensijas gaismas caurlaidībai jābūt apmēram 75 %, mērot pie 650 nm 1 cm kivetē pret nātrija hlorīda šķīdumu (4.3.). Šo suspensiju var glabāt apmēram 40C temperatūrā vienu nedēļu.
4. Barotnes un reaģenti
4.1. Barotne b
|
Gaļas peptons |
6,0 g |
|
Triptons |
4,0 g |
|
Rauga ekstrakts |
3,0 g |
|
Gaļas ekstrakts |
1,5 g |
|
Glikoze |
1,0 g |
|
Agars |
10 – 20 g |
|
Ūdens |
1000 ml |
|
pH 6,5 – 6,6 (pēc sterilizācijas) |
|
|
4.2. Barotne noteikšanai b |
|
|
Triptons |
10,0 g |
|
Rauga ekstrakts |
3,0 g |
|
Gaļas ekstrakts |
1,5 g |
|
Glikoze |
1,0 g |
|
Agars |
10 – 20,0 g |
|
Tween 80 |
1 ml |
|
Ūdens |
1000 ml |
|
pH 6,5 (pēc sterilizācijas) |
4.3. Nātrija hlorīda 0,8 % (m/V) šķīdums: 8 g nātrija hlorīda izšķīdina ūdenī un atšķaida līdz 1000 ml; sterilizē
4.4. Metanola/ ūdens/ sālsskābes maisījums: 80/17,5/2,5 (V/V/V)
4.5. Fosfāta buferšķīdums – pH 6,5
22,15 g Kālija hidrogēnfosfāts K2HPO4
27,85 g Kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4
Ūdens līdz 1000 ml
4.6. Sālsskābe – d: 1,18 – 1,19
4.7. 0,1 M sālsskābe
4.8. 1 M nātrija hidroksīda šķīdums
4.9. aptuveni 0,5 M nātrija sulfīda šķīdums šķīdums
4.10. Bromkrezolsarkanā 0,04 % (m/V) šķīdums: izšķīdina 0,1 g bromkrezolsarkanā 18,5 ml nātrija hidroksīda 0,01 N šķīdumā. Papildina ar ūdeni līdz 250 ml un samaisa
4.11. Standartviela: cinka bacitracīns ar zināmu aktivitāti (SV)
5. Standartšķīdumi
5.1. Iesver tādu standarta cinka bacitracīna (4.11.) daudzumu, kas atbilst 1050 SV (atbilstoši norādītajai aktivitātei). Pievieno 5 ml 0,1 N sālsskābes (4.7.) un atstāj uz 15 minūtēm. Pievieno 30 ml ūdens, ar fosfāta buferšķīdumu pH 6,5 (4.5.) (apmēram 4 ml), noregulē pH līdz 4,5, ar ūdeni uzpilda līdz 50 ml tilpumam un labi samaisa (1ml = 21 SV).
5.2. No šā šķīduma, pakāpeniski atšķaidot ar fosfāta buferšķīdumu pH 6,5, (4.5.) pagatavo šādus šķīdumus:
S8 0,42 SV/ml
S4 0,21 SV/ml
S2 0,105 SV/ml
S1 0,0525 SV/ml
6. Ekstrakta un noteikšanas šķīdumu gatavošana
6.1. Ekstrakcija:
6.1.1. Premiksi un minerālbarība;
Iesver 2,0 līdz 5,0 g parauga, pievieno 29 ml maisījuma (4.4.) un 1,0 ml nātrija sulfīda šķīduma (4.9.), un īsu brīdi krata. Pārbauda, vai pH ir apmēram 2. Krata 10 minūtes, pievieno 30 ml fosfāta buferšķīduma (4.5.), krata 15 minūtes un centrifugē. Ņem nepieciešamu virsnogulšņu šķīduma alikvotu daļu, ar 1 M nātrija hidroksīda šķīdumu (4.8.) noregulē pH līdz 6,5, kā indikatoru lietojot pH–metru vai bromkrezolsarkanā šķīdumu (4.10.). Atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (4.5.) tā, lai cinka bacitracīna paredzamais saturs būtu 0,42 SV/ml (= U8).
6.1.2. Olbaltumvielu koncentrāti;
Iesver 10,0 g parauga, pievieno 49 ml maisījuma (4.4.), 1 ml nātrija sulfīda šķīduma (4.9.) un īsu brīdi krata. Pārbauda, vai pH ir apmēram 2. Krata 10 minūtes, pievieno 50 ml fosfāta buferšķīduma (4.5.) un krata 15 minūtes un centrifugē. Ņem nepieciešamu centrifugāta alikvotu daļu, ar 1 M nātrija hidroksīda šķīdumu (4.8.) noregulē pH līdz 6,5, kā indikatoru lietojot pH–metru vai bromkrezolsarkanā šķīdumu (4.10.). Rotācijas ietvaicētājā temperatūrā, kas nepārsniedz 350C, ietvaicē aptuveni pusi no šķīduma tilpuma. Atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (4.5.) tā, lai cinka bacitracīna paredzamais saturs būtu 0,42 SV/ml (= U8).
6.1.3. Citu veidu barība;
Iesver 10,0 g parauga (20,0 g, ja cinka bacitracīna paredzamais saturs ir 5 mg/kg), pievieno 24,0 ml maisījuma (4.4.), 1,0 ml nātrija sulfīda šķīduma (4.9.) un apmēram 10 minūtes homogenizē. Pievieno 25 ml fosfāta buferšķīduma (4.5.), krata 15 minūtes un centrifugē. Ņem 20 ml centrifugāta, ar 1 M nātrija hidroksīda šķīdumu (4.8.) noregulē pH līdz 6,5, par indikatoru lietojot pH–metru vai bromkrezolsarkanā šķīdumu (4.9.). Ar rotācijas ietvaicētāju temperatūrā, kas nepārsniedz 35°C, ietvaicē līdz apmēram 4 ml. Atlikumu atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (4.5.) tā, lai cinka bacitracīna paredzamais saturs būtu 0,42 SV/ml (= U8).
6.2. Noteikšanas šķīdumi
No šķīduma U8 pagatavo šķīdumu U4 (paredzamais saturs: 0,21 SV/ml), U2 (paredzamais saturs: 0,105 SV/ml) un U1 (paredzamais saturs: 0,0525 SV/ml), tos secīgi atšķaidot (1 + 1) ar fosfāta buferšķīdumu (4.5.).
7. Noteikšanas metode
7.1. Inokulēšana barotnē
Baktēriju suspensiju (3.2.) apmēram 50°C temperatūrā inokulē noteikšanas barotnē (4.2.). Priekšmēģinājumos uz platēm ar noteikšanas barotni (4.2.) nosaka baktēriju suspensijas daudzumu, kas dažādām cinka bacitracīna koncentrācijām dod iespējami lielākās un skaidrākās inhibēšanas zonas.
7.2. Plašu sagatavošana
7.2.1. Difūziju agarā veic uz platēm ar visu četru koncentrāciju standartšķīdumiem (S8, S4, S2, S1) un visu četru koncentrāciju eksperimenta šķīdumiem (U8, U4, U2, U1). Uz visām platēm noteikti jābūt visu četru koncentrāciju ekstraktam un standartšķīdumam. Šajā nolūkā izvēlas pietiekami lielas plates, uz kurām agara barotnē var izveidot vismaz astoņas iedobes ar 10 – 13 mm diametru, atstājot starp to centriem vismaz 30 mm. Testu var veikt uz plates, kas izveidota no stikla plāksnes, uz kuras uzlikts 20 mm augsts anodēta alumīnija vai plastikas riņķis, kura diametrs ir 200 mm.
7.2.2. Uz platēm izlej tādu daudzumu barotnes (4.2.), kas saskaņā ar 7.1. punktu uzsēta tā, lai iegūtu apmēram 2 mm biezu slāni (60 ml uz plati ar 200 mm diametru). Atstāj sastingt horizontālā stāvoklī, izveido iedobumus un tajos precīzi nomērītā daudzumā iepilda eksperimenta šķīdumus un standartšķīdumus (no 0,10 līdz 0,15 ml uz iedobi atkarībā no diametra).
7.2.3. Katru koncentrāciju pārbauda vismaz četras reizes, lai katrā noteikšanā novērtētu vismaz 32 kavējuma zonas.
7.3. Inkubācija
Plates inkubē 16 – 18 stundas 30±2°C temperatūrā.
8. Novērtēšana
8.1. Ar 0,1 mm precizitāti izmēra inhibēšanas zonu diametru. Uz puslogaritmiskā papīra atzīmē punktus, kas atbilst inhibēšanas zonu vidējam diametram atkarībā no koncentrācijas. Novelk standartšķīdumam un ekstraktam “atbilstošākās” līnijas, piemēram, kā aprakstīts tālāk tekstā.
8.2. “Atbilstošāko” punktu standarta zemākajam līmenim (SL) nosaka pēc formulas:
7S1 + 4S2 +
S4 – 2S8
a) SL = ––––––––––––––––––
10
8.3. “Atbilstošāko” punktu standarta augstākajam līmenim (SH) nosaka pēc formulas:
7S8 + 4S4 +
S2 – 2S1
b) SH = ––––––––––––––––––
10
8.4. Līdzīgi aprēķina “atbilstošākos” punktus ekstrakta zemākajam koncentrācijas līmenim (UL) un augstākajam līmenim (UH), iepriekšminētajās formulās S1, S2, S4 un S8 attiecīgi aizstājot ar U1, U2, U4 un U8.
8.5. Uz tā paša puslogaritmiskā papīra atzīmē SL un SH lielumus, un tos savieno, iegūstot standartšķīduma “atbilstošāko” līniju. Līdzīgi atzīmē UL un UH, ko savieno, iegūstot ekstrakta “atbilstošāko” līniju.
8.6. Ja nav nekādu traucējošu faktoru, abām līnijām jābūt paralēlām. Praktiskos nolūkos līnijas var uzskatīt par paralēlām, ja (SH–SL) un (UH–UL) vērtības neatšķiras vairāk par 10 % no to vidējā lieluma.
8.7. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, var atmest U1 un S1 vai U8 un S8, bet SL, SH, UL un UH aprēķināt pēc alternatīvām formulām, iegūstot alternatīvas “atbilstošākās” līnijas:
5S1 + 2S2 –
S4
5S2 + 2S4 –
S8
a') SL = ––––––––––––– vai –––––––––––
6
6
5S4 + 2S2 –
S1
5S8 + 2S4 –
S2
b') SH = ––––––––––––– vai –––––––––––
6
6
8.8. Un līdzīgi aprēķina UL un UH. Alternatīvo “atbilstošāko” līniju paralelitāte būtu jāpārbauda, kā minēts iepriekš. Beigu ziņojumā jānorāda, ka rezultāts aprēķināts pēc trim līmeņiem.
8.9. Ja līnijas uzskata par paralēlām, relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) aprēķina pēc vienas no šīm formulām.
8.10. Četru līmeņu gadījumā:
(U1 + U2 +
U4 + U8 –
S1 – S2 –
S4 – S8) x 0.602
c) log A = –––––––––––––––––––––––––––––––––
U4 + U8 +
S4 + S8 – U1 –
U2 – S1 –
S2
8.11. Trīs līmeņu gadījumā:
(U1 + U2 +
U4 – S1 –
S2 – S4) x 0.401
d) log A = –––––––––––––––––––––––––––––
U4 + S4 –
U1 – S1
vai
(U2 + U4 +
U8 – S2 –
S4 – S8) x 0.401
d') log A = –––––––––––––––––––––––––––––
U8 + S8 –
U2 – S2
8.12. Parauga ekstrakta aktivitāte = atbilstošā standarta aktivitāte x A.
(U8 = S8 x A)
8.13. Ja relatīvā aktivitāte neiekļaujas intervālā no 0,5 līdz 2,0, noteikšanu atkārto, attiecīgi koriģējot ekstrakta koncentrācijas, vai, ja tas nav iespējams, koriģējot standartšķīdumu koncentrācijas. Ja relatīvo aktivitāti nevar iekļaut vajadzīgajās robežās, jebkurš iegūtais rezultāts jāuzskata par aptuvenu, un tas jānorāda beigu ziņojumā.
8.14. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, noteikšanu atkārto. Ja paralelitāti tomēr nepanāk, noteikšana jāuzskata par neapmierinošu.
8.15. Rezultātu izsaka cinka bacitracīna miligramos uz barības kilogramu.
9. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
9.1. 2 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja cinka bacitracīna saturs ir līdz 10 mg/kg;
9.2. 20 % no lielākā rezultāta, ja cinka bacitracīna saturs ir no 10 līdz 25 mg/kg;
9.3. 5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja cinka bacitracīna saturs ir no 25 līdz 50 mg/kg;
9.4. 10 % no lielākā rezultāta, ja cinka bacitracīna saturs pārsniedz 50 mg/kg.
1 1 mg barības kvalitātes cinka bacitracīna ir līdzvērtīgs 42 starptautiskajām vienībām (SV).
a) Var izmantot citas metodes, ja ir konstatēts, ka ar tām iegūst līdzīgas baktēriju suspensijas.
b) Var izmantot līdzīga sastāva komerciālās barotnes, ar kurām iegūst tādus pašus rezultātus.
Zemkopības ministrs M.Roze
31.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Flavofosfolipola noteikšana ar difūzijas metodi agara barotnē
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka flavofosfolipolu barībā, koncentrātos un premiksos. Zemākā noteikšanas robeža ir 1 mg/kg (1 ppm).
2. Princips
Paraugu ekstrahē ar atšķaidītu metanolu, karsējot ar atteces dzesinātāju. Pēc centrifugēšanas ekstraktu attīra, vajadzības gadījumā apstrādājot ar jonu apmaiņas sveķiem, un atšķaida. Tā antibiotisko aktivitāti nosaka, novērtējot flavofosfolipola difūziju agara barotnē, uz kuras uzsēts Staphylococcus aureus. Difūziju nosaka pēc mikroorganisma inhibēšanas zonu veidošanās. Pieņem, ka minēto zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotiku koncentrācijas logaritmam izmantoto antibiotiku koncentrāciju intervālā.
3. Mikroorganisms: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P.
3.1. Darba kultūras uzturēšana
Staphylococcus aureus uzsēj uz slīpagara barotnes (4.1.). Inkubē 24 stundas 37°C temperatūrā, glabā ledusskapī apmēram 4°C temperatūrā un reizi mēnesī atkārtoti pārsēj uz slīpagara.
3.2. Baktēriju suspensijas pagatavošana (var izmantot citas metodes, ja ir konstatēts, ka ar tām iegūst līdzīgas baktēriju suspensijas.)
Atliek divas mēģenes ar darba kultūru (3.1.) un reizi nedēļā atkārtoti uzsēj. Inkubē 24 stundas 37°C temperatūrā un glabā ledusskapī apmēram 4°C temperatūrā.
24 stundas pirms noteikšanas ar kultūru uzsēj divas līdz četras mēģenes ar slīpagara barotni (4.1.). Inkubē 16 – 18 stundas 37°C. Kultūras augumu suspendē nātrija hlorīda šķīdumā (4.3.). Suspensijas gaismas caurlaidībai pie 578 nm, mērot 1 cm kivetē pret nātrija hlorīda šķīdumu (4.3.), jābūt apmēram 40 %.
4. Barotnes un reaģenti
4.1. Barotne (var izmantot līdzīga sastāva standartbarotnes, ar kurām iegūst tādus pašus rezultātus, piemēram, oksoīdu antibiotiku barotni 1 (CM 3427) ar oksoīdā agara nr. 3 (L13) piedevu.)
6,0 g gaļas peptons
4,0 g triptons
3,0 g rauga ekstrakts
1,5 g gaļas ekstrakts
1,0 g glikoze
15,0 g agars
1000 ml ūdens
pH 6,5 (pēc sterilizācijas)
4.2. Noteikšanas vide:
4.2.1. Pamatslānis;
(Var izmantot līdzīga sastāva komerciālās barotnes, ar kurām iegūst tādus pašus rezultātus, piemēram, oksoīdu antibiotiku barotni 2 (CM 335) ar oksoīdā agara nr. 3 (L13) piedevu.)
6,0 g gaļas peptons
3,0 g rauga ekstrakts
1,5 g gaļas ekstrakts
10,0 g agars
1000 ml ūdens
pH 6,5 (pēc sterilizācijas)
4.2.2. Uzsējuma slānis;
Tāpat kā 4.1.apakšpunktā, tikai pievienojot 2,0 g silīcija pretputu emulsijas. (Piemēram, SE 2 no Wacker Chemie GmbH, Minhenē.)
4.3. Nātrija hlorīda šķīdums – 0,4 % (m/V): izšķīdina 4 g analītiski tīra nātrija hlorīda ūdenī un atšķaida līdz 1000 ml, sterilizē
4.4. Metanols – tīrs
4.5. Metanols, 50 % (V/V): atšķaida 500 ml metanola (4.4.) ar 500 ml ūdens
4.6. Metanols 80 % (V/V): atšķaida 800 ml metanola (4.4.) ar 200 ml ūdens
4.7. Tris(hidroksimetil)aminometāns, (analītiski tīrs)
4.8. Kālija hlorīda metanola šķīdums, 1,5 % (m/V): izšķīdina 1,5 g analītiski tīra kālija hlorīda 20 ml ūdens, uzpilda līdz 100 ml ar metanolu (4.4.)
4.9. Katjonu apmaiņas sveķi: Dowex 50W x 8, graudiņu lielums 20 – 50 mesh, Na formas (kat. Serva nr. 41600) vai līdzvērtīgi
4.10. Anjonu apmaiņas sveķi: Dowex 1x 2, graudiņu lielums 50 – 100 mesh, Cl formas (kat. Serva nr. 41010) vai līdzvērtīgi. Pirms lietošanas 12 – 14 stundas tur 80 % metanolā (4.6.)
4.11. Stikla vate
4.12. pH indikatora papīrs (pH 6,6 – 8,1)
4.13. Askorbīnskābe
4.14. Standartviela: flavofosfolipols ar zināmu aktivitāti
5. Iekārtas
5.1. 150 – 200 mm gara hromatogrāfijas stikla kolonna ar 9 mm iekšējo diametru, kuras apakšgala sašaurinātajā daļā ir krāns un augšgalā slīpēta stikla savienojums šķirpiltuves (5.2.) pievienošanai
5.2. Pilināmā piltuve (250 ml) ar krānu un slīpēta stikla savienojumu
5.3. 250 ml koniskā kolba ar slīpēta stikla savienojumu
5.4. Atteces dzesinātājs ar slīpēta stikla savienojumu
6. Standartšķīdumi
6.1. Precīzi nosvērtu standartvielas (4.14.) daudzumu izšķīdina 50 % metanolā (4.5.) un atšķaida, lai iegūtu izejas šķīdumu, kas satur 100 µg flavofosfolipola uz mililitru. Noslēgtās kolbās 4 °C temperatūrā šis šķīdums ir stabils līdz diviem mēnešiem.
6.2. No šā izejas šķīduma, secīgi atšķaidot ar 50 % metanolu (4.5.), gatavo šādus šķīdumus:
S8 0,2 µg/ml
S4 0,1 µg/ml
S2 0,05 µg/ml
S1 0,025 µg/ml
7. Ekstrakta gatavošana
7.1. Ekstrakcija:
7.1.1. Koncentrāti, premiksi un minerālbarība;
Iesver 2,0 līdz 5,0 g parauga un pievieno apmēram 150 mg askorbīnskābes (4.13.). Homogenizē ar 150 ml 50 % metanola (4.5.) koniskā kolbā (5.3.) un ar apmēram 400 mg tris (hidroksimetil) aminometāna (4.7.) noregulē pH līdz 8,1 – 8,2. Ar indikatora papīrīti (4.12.) pārbauda pH. Atstāj uz 15 minūtēm, tad ar tris (hidroksimetil) aminometānu (4.7.) atkārtoti noregulē pH līdz 8,1 – 8,2 un, nepārtraukti maisot, 10 minūtes vāra ar atteces dzesinātāju (5.4.). Ļauj atdzist, centrifugē maisījumu un dekantē centrifugātu.
7.1.2. Citu veidu barība;
Iesver 5,0 – 30,0 g parauga, kas satur vismaz 30 µg flavofosfolipola. Homogenizē ar 150 ml 50 % metanola (4.5.) koniskā kolbā (5.3.) un ar apmēram 400 mg tris (hidroksimetil) aminometāna (4.7.) noregulē pH līdz 8,1 – 8,2. Ar indikatora papīrīti (4.12.) pārbauda pH. Atstāj uz 15 minūtēm, tad ar tris (hidroksimetil) aminometānu (4.7.) atkārtoti noregulē pH līdz 8,1 – 8,2 un, nepārtraukti maisot, 10 minūtes vāra ar atteces dzesinātāju (5.4.). Ļauj atdzist, centrifugē maisījumu un dekantē centrifugātu.
7.2. Attīrīšana (šo stadiju var izlaist koncentrātu, premiksu un minerālbarības analīzē)
7.2.1. Sajauc 110 ml ekstrakta ar 11 g katjonu apmaiņas sveķu (4.9.), nepārtraukti maisot vāra vienu minūti ar atteces dzesinātāju (5.4.). Katjonu apmaiņas sveķus atdala, centrifugējot vai filtrējot. Sajauc 100 ml ekstrakta ar 150 ml metanola (4.4.), un šķīdumu 12 – 15 stundas iztur 4°C temperatūrā. Kamēr šķīdums nav sasilis, nofiltrē izgulsnēto vielu.
7.2.2. Stikla caurules (5.1.) apakšgalā ieliek stikla vates tamponu (4.11.), caurulē pārnes 5 ml anjonu apmaiņas sveķu (4.10.) un izmazgā kolonnu ar 100 ml 80 % metanola (4.6.). Lietojot piltuvi (5.2.), uz kolonnu pārnes vismaz 100 ml filtrāta, kura paredzamais flavofosfolipola saturs ir 16 µg (200 ml uz 30 g barības parauga 1 ppm). Ja vajadzīgs, pirms pārnešanas uz kolonnu, filtrātu atšķaida ar 80 % metanolu (4.6.), lai iegūtu paredzamo flavofosfolipola saturu 16 µg/100 ml. Tecēšanas ātrumu noregulē apmēram 2 ml/minūtē. Eluātu izmet. Tad kolonnu izmazgā ar 50 ml 80 % metanola (4.6.) un eluātu izmet.
7.2.3. Flavofosfolipolu eluē ar kālija hlorīda metanola šķīdumu (4.8.), tecēšanas ātrumu uzturot apmēram 2 ml/minūtē. Savāc mērkolbā 50 ml eluāta, pievieno 30 ml ūdens un samaisa. Šā šķīduma flavofosfolipola saturam vajadzētu būt 0,2 µg/ml (=U8).
7.3. Noteikšanas šķīdumi
7.3.1. Ja vajadzīgs, t.i., ja ir izlaista attīrīšanas stadija, saskaņā ar 7.1.1. punktu iegūto ekstraktu atšķaida ar 50 % metanolu (4.5.), lai iegūtu paredzamo flavofosfolipola saturu 0,2 µg/ml (= U8).
7.3.2. No šķīduma U8, to secīgi atšķaidot (1 + 1) ar 50 % metanolu (4.5.), pagatavo šķīdumu U4 ar paredzamo saturu 0,1 µg/ml, U2 ar paredzamo saturu 0,05 µg/ml un U1 ar paredzamo saturu 0,025 µg/ml.
8. Eksperimenta norise
8.1. Eksperimenta vides uzsēšana
Baktēriju suspensiju (3.2.) apmēram 50°C temperatūrā inokulē noteikšanas barotnē (4.2.2.). Priekšmēģinājumos uz platēm ar noteikšanas barotni (4.2.2.) nosaka, kāds baktēriju suspensijas daudzums vajadzīgs, lai radītu lielākās un skaidrākās inhibēšanas zonas, kas atbilst dažādajām flavofosfolipola koncentrācijām (apmēram 30 ml/l).
8.2. Plašu gatavošana
8.2.1. Difūziju agarā izdara uz platēm ar četru dažādu koncentrāciju standartšķīdumiem (S8, S4, S2, S1) un visu četru koncentrāciju eksperimenta šķīdumiem (U8, U4, U2, U1). Šo četru dažādo koncentrāciju ekstrakta šķīdumiem un standartšķīdumiem noteikti jābūt uz katras plates. Šajā nolūkā izvēlas pietiekami lielas plates, uz kurām agara barotnē var izveidot vismaz astoņas iedobes ar 10 – 13 mm diametru, starp iedobju centriem atstājot vismaz 30 mm. Testu var veikt uz plates, kas sastāv no stikla plāksnes, uz kuras uzlikts 20 mm augsts anodēta alumīnija vai plastikas riņķis, kura diametrs ir 200 mm.
8.2.2. Uz platēm izlej tādu daudzumu barotnes (4.2.1.), lai izveidotos apmēram 1,5 mm biezs slānis (45 ml uz plati ar 200 mm diametru). Agaram ļauj sastingt horizontālā stāvoklī, tad pārklāj ar tādu daudzumu barotnes (4.2.2.), kas uzsēta saskaņā ar 8.1. punktu, lai izveidotos 1 mm biezs slānis (30 ml uz plati ar 200 mm diametru). Vēlreiz ļauj sastingt horizontālā stāvoklī, izveido iedobes, un tajās precīzi nomērītā daudzumā iepilda noteikšanas šķīdumus un standartšķīdumus (no 0,10 līdz 0,15 ml iedobē atkarībā no diametra).
8.2.3.Katru koncentrāciju pārbauda vismaz četras reizes, lai katrā noteikšanā novērtētu vismaz 32 inhibēšanas zonas.
8.3. Inkubēšana
Plates inkubē 16 – 18 stundas 28 – 30°C temperatūrā.
9. Novērtēšana
9.1. Izmēra inhibēšanas zonu diametru ar 0,1 mm precizitāti. Katrai koncentrācijai atbilstīgos vidējos mērījumus reģistrē uz puslogaritmiskā papīra, parādot koncentrāciju logaritmu attiecībā pret inhibēšanas zonu diametriem. Novelk standartšķīdumam un ekstraktam “atbilstošākās” līnijas, piemēram, šādi:
9.2. “Atbilstošāko” punktu standarta zemākajam līmenim (SL) nosaka pēc formulas:
7S1 + 4S2 +
S4 – 2S8
a) SL = ––––––––––––––––––
10
9.3. “Atbilstošāko” punktu standarta augstākajam līmenim (SH) nosaka pēc formulas:
7S8 + 4S4 +
S2 – 2S1
b) SH = ––––––––––––––––––
10
9.4. Līdzīgi aprēķina “atbilstošākos” punktus ekstrakta zemākajam koncentrācijas līmenim (UL) un augstākajam līmenim (UH), iepriekšminētajās formulās S1, S2, S4 un S8 aizstājot attiecīgi ar U1, U2, U4 un U8.
9.5. Tajā pašā grafikā atzīmē SL un SH lielumus, un tos savieno, iegūstot standartšķīdumam “atbilstošāko” līniju. Līdzīgi atzīmē UH un UL, ko savieno, iegūstot ekstraktam “atbilstošāko” līniju.
9.6. Ja nav nekādu traucējošu faktoru, abām līnijām jābūt paralēlām. Praktiskos nolūkos līnijas var uzskatīt par paralēlām, ja (SH–SL) un (UH–UL) vērtības neatšķiras vairāk par 10 % no to vidējā lieluma.
9.7. Konstatējot, ka līnijas nav paralēlas, var atmest U1 un S1 vai U8 un S8, un SL, SH, UL un UH aprēķināt pēc alternatīvām formulām, iegūstot alternatīvas “atbilstošākās” līnijas:
5S1 + 2S2 –
S4
5S2 + 2S4 –
S8
a') SL = ––––––––––––– vai –––––––––––
6
6
5S4 + 2S2 –
S1
5S8 + 2S4 –
S2
b') SH = ––––––––––––– vai –––––––––––
6
6
un līdzīgi aprēķina UL un UH. Alternatīvo “atbilstošāko” līniju paralelitāte būtu jāpārbauda, kā minēts iepriekš. Ja rezultāti aprēķināti pēc trim līmeņiem, tas jāatzīmē beigu ziņojumā.
9.8. Ja līnijas uzskata par paralēlām, aprēķina relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) pēc vienas no šīm formulām.
9.8.1. Četru līmeņu gadījumā:
(U1 + U2 +
U4 + U8 –
S1 – S2 –
S4 – S8) x 0.602
c) log A = –––––––––––––––––––––––––––––––––
U4 + U8 +
S4 + S8 – U1 –
U2 – S1 –
S2
9.8.2. Trīs līmeņu gadījumā:
(U1 + U2 +
U4 – S1 –
S2 – S4) x 0.401
d) log A = –––––––––––––––––––––––––––––
U4 + S4 –
U1 – S1
vai
(U2 + U4 +
U8 – S2 –
S4 – S8) x 0.401
d') log A = –––––––––––––––––––––––––––––
U8 + S8 –
U2 – S2
9.9. Faktiskā aktivitāte = pieņemtā aktivitāte x relatīvā aktivitāte.
9.10. Ja līnijas nevar uzskatīt par paralēlām, noteikšanu atkārto. Ja paralelitāti tomēr nepanāk, relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) aprēķina pēc c) formulas. Tomēr iegūtais rezultāts jāuzskata par aptuvenu, un tas jāatzīmē beigu ziņojumā.
10. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
10.1. 0,5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja flavofosfolipola saturs ir no 1 līdz 2 mg/kg;
10.2. 25 % no lielākā rezultāta, ja flavofosfolipola saturs ir lielāks par 2 un mazāks par 10 mg/kg;
10.3. 20 % no lielākā rezultāta, ja flavofosfolipola saturs ir lielāks par 10 un mazāks par 25 mg/kg;
10.4. 5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja flavofosfolipola saturs ir lielāks par 25 un mazāks par 50 mg/kg;
10.5. 10 % no lielākā rezultāta, ja flavofosfolipola saturs pārsniedz 50 mg/kg.
Zemkopības ministrs M.Roze
32.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Mikroelementu – dzelzs, vara, mangāna un cinka – noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka mikroelementus – dzelzi, varu, mangānu un cinku barībā. Zemākā noteikšanas robeža ir: dzelzs (Fe): 20 mg/kg, varš (Cu) : 10 mg/kg, mangāns (Mn) : 20 mg/kg un cinks (Zn) : 20 mg/kg.
2. Princips
Pēc organisko vielu noārdīšanās, ja tādas ir, paraugu izšķīdina sālsskābē. Mikroelementus – dzelzi, varu, mangānu un cinku – pēc attiecīgas atšķaidīšanas nosaka ar atomu absorbcijas spektrometrijas metodi.
3. Reaģenti
Ievada komentāri. Reaģentu un analītisko šķīdumu gatavošanā lieto nosakāmos katjonus nesaturošu ūdeni, ko iegūst, divreiz destilējot ūdeni borsilikātstikla destilācijas iekārtā vai kvarca destilācijas iekārtā vai divreiz apstrādājot ar jonu apmaiņas sveķiem. Reaģentiem jābūt vismaz analītiskās tīrības (a.p.) kvalitātē. Tas, ka nosakāmā elementa nav, jāpārbauda tukšā eksperimentā. Vajadzības gadījumā reaģentu attīrīšana jāturpina. Še turpmāk aprakstītos standartšķīdumus var aizstāt ar gataviem komerciāli pieejamiem standartšķīdumiem, ja tiem ir garantija un tie pirms lietošanas ir pārbaudīti.
3.1. Analītiski tīra sālsskābe (d: 1,19);
3.2. Analītiski tīra sālsskābe (6 N);
3.3. Analītiski tīra sālsskābe (0,5 N);
3.4. Fluorūdeņražskābe (38 – 40 % (V/V)), kuras dzelzs saturs ir mazāks par 1 mg Fe/litrā un kuras atlikums pēc ietvaicēšanas ir mazāks par 10 mg (sulfāta)/litrā;
3.5. Analītiski tīra sērskābe (d: 1,84);
3.6. Analītiski tīrs ūdeņraža peroksīds (apmēram 100 skābekļa tilpumi (30 % pēc svara));
3.7. Dzelzs standartšķīdums (1000 µg Fe/ml), ko gatavo šādi: izšķīdina 1 g analītiski tīras dzelzs stieplītes 200 ml 6 N sālsskābes (3.2.), pievieno 16 ml ūdeņraža peroksīda (3.6.) un uzpilda līdz vienam litram ar ūdeni – dzelzs darba standartšķīdums (100 µg Fe/ml), ko gatavo, atšķaidot vienu daļu standartšķīduma ar 9 daļām ūdens;
3.8. Vara standartšķīdums (1000 µg Cu/ml), ko gatavo šādi: izšķīdina 1 g analītiski tīra pulverveida vara 25ml 6 N sālsskābes (3.2.), pievieno 5 ml ūdeņraža peroksīda (3.6.) un uzpilda līdz vienam litram ar ūdeni. Vara darba standartšķīdums (10 µg Cu/ml), ko gatavo, atšķaidot 1 daļu standartšķīduma ar 9 daļām ūdens un pēc tam 1 daļu iegūtā šķīduma vēlreiz atšķaida ar 9 daļām ūdens;
3.9. Mangāna standartšķīdums (1000 µg Mn/ml), ko gatavo šādi: izšķīdina 1 g analītiski tīra pulverveida mangāna 25 ml 6 N sālsskābes (3.2.) un uzpilda līdz vienam litram ar ūdeni. Mangāna darba standartšķīdums (10 µg Mn/ml), ko gatavo, atšķaidot vienu daļu standartšķīduma ar 9 daļām ūdens un pēc tam 1 daļu iegūtā šķīduma vēlreiz atšķaida ar 9 daļām ūdens;
3.10. Cinka standartšķīdums (1000 µg Zn/ml), ko gatavo šādi: izšķīdina 1 g analītiski tīra cinka lentītes vai plāksnītes 25 ml 6 N sālsskābes (3.2.) un uzpilda līdz vienam litram ar ūdeni. Cinka darba standartšķīdums (10 µg Zn/ml), ko gatavo, atšķaidot 1 daļu standartšķīduma ar 9 daļām ūdens un pēc tam 1 daļu iegūtā šķīduma vēlreiz atšķaida ar 9 daļām ūdens;
3.11. Lantāna hlorīda šķīdums, ko gatavo šādi: izšķīdina 12 g lantāna oksīda 150 ml ūdens, pievieno 100 ml 6 N sālsskābes (3.2.) un uzpilda līdz vienam litram ar ūdeni.
4. Iekārtas
4.1. Mufeļkrāsns ar termoregulatoru un pašrakstītāju;
4.2. Jālieto izturīgi borsilikātstikla trauki un ieteicams lietot iekārtu, kas paredzēta tikai mikroelementu noteikšanai;
4.3. Platīna tīģelis un (pēc izvēles) kvarca tīģelis;
4.4. Atomu absorbcijas spektrofotometrs, kas atbilst tām metodes prasībām, kuras attiecas uz jutību un precizitāti vajadzīgajā intervālā.
5. Procedūra
5.1. Paraugi, kas satur organiskas vielas:
5.1.1. Pārpelnošana un šķīduma gatavošana analīzei *:
5.1.1.1. paraugu, kura svars ir 5 – 10g un kas nosvērts ar 0,2 mg precizitāti, liek kvarca vai platīna tīģelī (4.3.) (skat. b) piezīmi), žāvē žāvēšanas skapī 105°C temperatūrā un liek tīģeli aukstajā mufeļkrāsnī (4.1.). Krāsni aizver (skat. c) piezīmi) un apmēram 90 minūtēs pakāpeniski paaugstina temperatūru līdz 450 – 475°C. Šo temperatūru uztur 4 – 16 stundas, piemēram, atstājot pa nakti, lai atdalītu oglekli saturošas vielas, tad atver krāsni un ļauj atdzist (skat. d) piezīmi).
5.1.1.2. Tīģeli mazgā ar sālsskābi (3.1.) ar kopējo tilpumu apmēram 5 ml, pēdējo lēni un uzmanīgi pievieno vārglāzes saturam (var notikt strauja reakcija ar CO2 izdalīšanos). Pa pilienam pievieno sālsskābi (3.1.) un krata, līdz burbuļu veidošanās pilnīgi izbeidzas. Ietvaicē līdz sausam stāvoklim, palaikam maisot ar stikla nūjiņu.
5.1.1.3. Atlikumam pievieno 15 ml 6 N sālsskābes (3.2.) un pēc tam apmēram 120 ml ūdens. Samaisa ar stikla nūjiņu, kas jāatstāj vārglāzē, un pārsedz vārglāzi ar pulksteņstikliņu. Uzmanīgi karsē līdz viršanai un uztur viršanas punktā, līdz vairs neredz, ka šķīstu pelni. Izfiltrē caur bezpelnu filtrpapīru un savāc filtrātu 250 ml mērkolbā. Izmazgā vārglāzi un filtru ar 5 ml karstas 6 N sālsskābes (3.2.) un divreiz ar verdošu ūdeni. Uzpilda mērkolbu līdz zīmei ar ūdeni (HCl koncentrācija ir apmēram 0,5 N);
5.1.1.4. Ja atlikums filtrā izskatās melns (ogleklis), to liek atpakaļ krāsnī un pārpelno vēlreiz 450 – 475°C temperatūrā. Šī pārpelnošana, kurai ir vajadzīgas tikai dažas (apmēram trīs līdz piecas) stundas, ir pabeigta, kad pelni izskatās balti vai gandrīz balti. Izšķīdina atlikumu apmēram 2 ml sālsskābes (3.1.), ietvaicē līdz sausam un pievieno 5 ml 6 N sālsskābes (3.2.). Karsē, iefiltrē šķīdumu mērkolbā un uzpilda līdz atzīmei ar ūdeni (HCl koncentrācija ir apmēram 0,5 N).
Piezīmes:
a) mikroelementu noteikšanā ir svarīgi ņemt vērā analīzes piesārņošanās risku, īpaši ar cinku, varu un dzelzi. Tāpēc piederumiem, kurus izmanto paraugu gatavošanai, jābūt bez šiem metāliem.
Lai mazinātu vispārējo piesārņošanās risku, strādā bezputekļu atmosfērā ar ļoti tīrām iekārtām un kārtīgi izmazgātiem traukiem. Cinka noteikšana ir īpaši jutīga pret dažādu veidu piesārņojumiem, piemēram, no traukiem, reaģentiem, putekļiem u.tml.;
b) pārpelnojamā parauga svaru aprēķina pēc aptuvenā mikroelementa satura barībā, ņemot vērā lietojamā spektrofotometra jutību. Ja barības mikroelementu saturs ir zems, varbūt jāsāk ar 10 – 20 g parauga un beigu šķīdums jāuzpilda tikai līdz 100 ml;
c) pārpelnošana jāveic slēgtā krāsnī bez gaisa vai skābekļa pieplūdes;
d) pirometra rādītā temperatūra nedrīkst pārsniegt 475 °C.
5.1.2. Spektrofotometriskā noteikšana:
5.1.2.1. Kalibrēšanas šķīdumu gatavošana;
Katra elementa noteikšanai no darba standartšķīdumiem, kas aprakstīti 3.7., 3.8., 3.9. un 3.10.apakšpunktā, gatavo kalibrēšanas šķīdumus, katra kalibrēšanas šķīduma HCl koncentrācija ir aptuveni 0,5 N, un (dzelzij, mangānam un cinkam) lantāna hlorīda koncentrācija ir līdzvērtīga 0,1% La (m/V). Mikroelementu izvēlētajām koncentrācijām jābūt spektrofotometra jutības intervālā. Tabulās ar piemēriem parādīts tipisku kalibrēšanas šķīdumu sastāvs. Tomēr atkarībā no spektrofotometra jutības var tikt izvēlētas citas koncentrācijas.
Dzelzs
|
µg Fe/ml |
0 |
0.5 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
ml darba standartšķīduma (3.7.1.) (1ml =100 µg Fe) + ml 6 N HCl (3.2.) |
0 7 |
0,5 7 |
1 7 |
2 7 |
3 7 |
4 7 |
5 7 |
|
+ 10 ml lantāna hlorīda šķīduma (3.11.), un uzpilda līdz 100 ml ar ūdeni. |
|||||||
Varš
|
µg Cu/ml |
0 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
1,0 |
|
ml darba standartšķīduma (3.8.1.) (1ml =10 µg Cu) + ml 6 N HCl (3.2.) |
0 8 |
1 8 |
2 8 |
4 8 |
6 8 |
8 8 |
10 8 |
|
Uzpilda līdz 100 ml ar ūdeni. |
|||||||
Mangāns
|
µg Mn/ml |
0 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
1,0 |
|
ml darba standartšķīduma (3.9.1.) (1ml =10 µg Mn) + ml 6 N HCl (3.2.) |
0 7 |
1 7 |
2 7 |
4 7 |
6 7 |
8 7 |
10 7 |
|
+ 10 ml lantāna hlorīda šķīduma (3.11.), un uzpilda līdz 100 ml ar ūdeni. |
|||||||
Cinks
|
µg Zn/ml |
0 |
0,05 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
|
ml darba standartšķīduma (3.10.1.) (1ml =10 µg Zn) + ml 6 N HCl (3.2.) |
0 7 |
0,5 7 |
1 7 |
2 7 |
4 7 |
6 7 |
8 7 |
|
+ 10 ml lantāna hlorīda šķīduma (3.11.), un uzpilda līdz 100 ml ar ūdeni. |
|||||||
5.1.2.2. Šķīduma gatavošana analīzei;
Vara noteikšanai saskaņā ar 5.1.1. punktu gatavoto šķīdumu parasti var lietot tieši. Ja tā koncentrācija jānoregulē atbilstīgi kalibrēšanas šķīdumiem, alikvotu daļu var pārnest ar pipeti uz 100 ml mērkolbu un uzpildīt līdz atzīmei ar 0,5 N sālsskābi (3.3.). Dzelzs, mangāna un cinka noteikšanai saskaņā ar 5.1.1. punktu gatavotā šķīduma alikvotu daļu pārnes ar pipeti uz 100 ml mērkolbu, pievieno 10 ml lantāna hlorīda šķīduma (3.11.) un uzpilda līdz atzīmei ar 0,5 N sālsskābi (3.3.) (skatīt arī 8. punktu “Piezīmes”).
5.1.2.3. Tukšais eksperiments;
Tukšais eksperiments ietver visas iepriekš aprakstītās procedūras stadijas, izņemot to, ka parauga materiāls ir izlaists. Kalibrēšanas šķīdumu “0” nedrīkst lietot par tukšo šķīdumu.
5.1.2.4. Atomu absorbcijas mērīšana.
Izmēra kalibrēšanas šķīdumu un analizējamā šķīduma atomu absorbciju, lietojot oksidējošu gaisa – acetilēna liesmu šādos viļņu garumos: Fe: 248,3 nm, Cu: 324,8 nm, Mn: 279,5 nm un Zn: 213,8 nm. Katru mērījumu izdara četras reizes.
5.2. Minerālbarība
Ja paraugā nav organisku vielu, iepriekšēja pārpelnošana nav vajadzīga. Rīkojas, kā aprakstīts 5.1.1.i) punktā, sākot ar otro rindkopu. Ietvaicēšanu ar fluorūdeņražskābi var izlaist.
6. Rezultātu aprēķināšana
Aprēķina mikroelementu koncentrāciju analizējamā šķīdumā, izmantojot kalibrācijas līknes, un rezultātu izsaka mikroelementa miligramos uz parauga kilogramu (ppm).
7. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
7.1. 5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja attiecīgā mikroelementa saturs ir līdz 50 mg/kg;
7.2. 10% no lielākā rezultāta, ja attiecīgā mikroelementa saturs ir no 50 līdz 100 mg/kg;
7.3. 10 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja attiecīgā mikroelementa saturs ir no 100 līdz 200 mg/kg;
7.4. 5 % no lielākā rezultāta, ja attiecīgā mikroelementa saturs pārsniedz 200 mg/kg.
8. Piezīmes
Fosfātu klātbūtne lielos daudzumos var traucēt dzelzs, mangāna un cinka noteikšanu. Minētā traucējošā ietekme jānovērš, pievienojot lantāna hlorīda šķīdumu (3.11.). Tomēr,
Ca + Mg
ja paraugā svaru attiecība ir ––––––––– · 2,
P
lantāna hlorīda šķīdumu (3.11.) var nepievienot analizējamam šķīdumam un kalibrēšanas šķīdumiem.
* Svaiga vai žāvēta rupjā zaļbarība satur lielu daudzumu silīcija, kas var saistīt mikroelementus, un tamdēļ tas jāatdala. Tāpēc, gatavojot minētās barības paraugus, jāievēro šāda modificēta procedūra. Veic 5.1.1. i) punktā paredzēto darbību līdz filtrēšanai. Filtrpapīru, kas satur nešķīstošo atlikumu, divreiz izmazgā ar verdošu ūdeni un liek platīna tīģelī (4.3.). Dedzina mufeļkrāsnī (4.1.) temperatūrā, kas ir zemāka par 550 °C, līdz visas oglekli saturošās vielas ir pilnīgi izzudušas. Ļauj atdzist, pievieno dažus pilienus ūdens, pēc tam 10 – 15 ml fluorūdeņražskābes (3.4.) un apmēram 150 °C temperatūrā ietvaicē līdz sausam. Ja atlikumā saglabājas silīcijs, to no jauna izšķīdina dažos mililitros fluorūdeņražskābes (3.4.) un ietvaicē līdz sausam. Pievieno piecus pilienus sērskābes (3.5.) un karsē, līdz vairs neizdalās balti dūmi. Pievieno 5 ml 6 N sālsskābes (3.2.) un apmēram 30 ml ūdens, karsē, šķīdumu iefiltrē 250 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar ūdeni (HCl koncentrācija ir apmēram 0,5 N). Pēc tam turpina noteikšanu, kā aprakstīts punktā 5.1.2.
Zemkopības ministrs M.Roze
33.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Avoparcīna noteikšana ar difūzijas metodi agara barotnē
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka avoparcīnu barībā un premiksos. Zemākā noteikšanas robeža ir 2 mg/kg (2 ppm). Noteikšanu var traucēt poliēteru antibiotiku klātbūtne.
2. Princips
Paraugu ekstrahē ar acetona, ūdens un sālsskābes maisījumu. Ekstrakta antibiotisko aktivitāti nosaka, mērot avoparsīna difūziju agara barotnē, kurā inokulēta Bacillus subtilis kultūra. Difūziju nosaka pēc mikroorganisma inhibēšanas zonu veidošanās. Pieņem, ka izmantoto antibiotisko vielu koncentrāciju intervālā šo zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotikas koncentrācijas logaritmam.
3. Mikroorganisms: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)
3.1. Kultūras uzturēšana
Mēģenēs ar slīpagaru (4.1.) inokulē Bacillus subtilis un inkubē diennakti 30°C temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī apmēram 4°C temperatūrā. Katru mēnesi atkārtoti pārsēj.
3.2. Sporu suspensijasgatavošana1
Savāc pieaugumu no svaigi sagatavotas slīpagara barotnes (3.1.) ar 2 – 3 ml sterila ūdens. Šo suspensiju iesēj 300 ml barotnes (4.1.) Rū kolbā, ko inkubē no trim līdz piecām dienām 30°C temperatūrā. Augumu savāc ar 15 ml etilspirta (4.2.), iepriekš ar mikroskopu pārbaudot sporulāciju, un labi samaisa. Šo suspensiju var glabāt vismaz piecus mēnešus 4°C temperatūrā.
4. Barotnes un reaģenti
4.1. Barotne 2
Peptons
Triptons 6,0 g
Rauga ekstrakts4,0 g
Gaļas ekstrakts3,0 g
Glikoze1,5 g
Agars1,0 g
Ūdens15,0 g
1000 ml, pH 6,5 (pēc sterilizācijas)
4.2. Etilspirts – 20 % (V/V): atšķaida 200 ml etilspirta ar 800 ml ūdens
4.3. Sālsskābe – d: 1,18 – 1,19
4.4. Nātrija hidroksīds – 2 M šķīdums
4.5. Fosfāta buferšķīdums, 0,1 M:
13,6 g kālija dihidrogēnfosfāts, KH2PO4
ūdens līdz 1000 ml
Noregulē pH līdz 4,5
4.6. Acetona, ūdens un sālsskābes (4.3.) maisījums: 65:32,5:2,5 (V/V/V)
4.7. Standartviela: avoparsīna sulfāts ar zināmu aktivitāti
5. Standartšķīdumi
5.1. Precīzi nosvērtu apmēram 10 mg standartvielas (4.7.) daudzumu izšķīdina fosfāta buferšķīdumā (4.5.) un atšķaida ar minēto buferšķīdumu, lai iegūtu izejas šķīdumu, kas satur 100 µg avoparsīna mililitrā. Glabājot noslēgtā kolbā 4°C temperatūrā, šis šķīdums ir stabils līdz septiņām dienām.
5.2. Premiksiem
Šo izejas šķīdumu pakāpeniski atšķaidot ar buferšķīdumu (4.5.), pagatavo šādus šķīdumus:
S8 4,0 µg/ml
S4 2,0 µg/ml
S2 1.0 µg/ml
S1 0,5 µg/ml
5.3. Barībai
Šo izejas šķīdumu pakāpeniski atšķaidot ar buferšķīdumu (4.5.), pagatavo šādus šķīdumus:
S8 2,0 µg/ml
S4 1,0 µg/ml
S2 0,5 µg/ml
S1 0,25 µg/ml
6. Ekstrakta un analizējamo šķīdumu gatavošana
6.1. Premiksi
6.1.1. Nosver paraugu ar 10 mg precizitāti, kas ir pietiekams, lai saturētu 10 – 100 mg avoparsīna. Pārnes uz 100 ml mērkolbu, kurā ir 60 ml maisījuma (4.6.), un 15 minūtes krata ar mehānisko kratītāju. Pārbauda pH un, ja vajadzīgs, ar sālsskābi (4.3.) noregulē līdz pH 2. Uzpilda līdz atzīmei ar maisījumu (4.6.) un labi samaisa. Daļu izfiltrē caur piemērotu filtrpapīru, piemēram, vatmaņpapīru nr. 1, izmetot pirmos 5 ml filtrāta. Ņem alikvotu daļu un ar nātrija hidroksīda šķīdumu (4.4.) noregulē pH līdz 4,5. Šo šķīdumu atšķaida ar buferšķīdumu (4.5.), lai iegūtu sagaidāmo avoparsīna koncentrāciju 4 µg/ml (=U8).
6.1.2. Šo šķīdumu pakāpeniski atšķaidot (1 + 1) ar buferšķīdumu (4.5.), gatavo šķīdumu U4 (sagaidāmais saturs 2 µg/ml), U2 (sagaidāmais saturs 1 µg/ml) un U1 (sagaidāmais saturs 0,5 µg/ml).
6.2. Barība
6.2.1. Nosver 50 g parauga un pārnes uz kolbu ar 100 ml maisījuma (4.6.). Krata ar mehānisko kratītāju 30 minūtes. Ekstraktu dzidrina, centrifugējot slēgtās centrifūgas mēģenēs. Ņem alikvotu daļu dzidrā ekstrakta (skat. tabulā tālāk tekstā) un ar nātrija hidroksīda šķīdumu (4.4.) noregulē pH līdz 4,5. Alikvoto daļu atšķaida ar buferšķīdumu (4.5.), lai iegūtu U8 (skat. tabulā tālāk tekstā).
6.2.2. Šo šķīdumu pakāpeniski atšķaidot (1 + 1) ar buferšķīdumu (4.5.), gatavo šķīdumu U4 (sagaidāmais saturs 1 µg/ml), U2 (sagaidāmais saturs 0,5 µg/ml) un U1 (sagaidāmais saturs 0,25 µg/ml).
|
Iepriekš pieņemtais avoparsīna saturs (mg/kg) |
5 |
7,5 |
10 |
15 |
20 |
40 |
|
Parauga svars (g (±0,1 g)) |
50 |
50 |
50 |
50 |
50 |
50 |
|
Maisījuma (4.6.) tilpums (ml) |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
|
Dzidrā ekstrakta tilpums (ml) |
20 |
15 |
20 |
15 |
20 |
10 |
|
Galīgais tilpums (ml): U8 |
25 |
25 |
50 |
50 |
100 |
100 |
|
Sagaidāmā U8 koncentrācija (µg/ml) |
2 |
apm. 2 |
2 |
apm. 2 |
2 |
2 |
7. Noteikšanas metode
7.1. Inokulēšana barotnē
Sporu suspensiju (3.2.) 50 – 60°C temperatūrā iesēj barotnē (4.1.). Priekšmēģinājumos uz platēm ar barotni (4.1.) nosaka, kāds sporu suspensijas daudzums ir vajadzīgs, lai ar dažādu koncentrāciju avoparsīnu iegūtu lielākās un skaidrākās kavējuma zonas.
7.2. Plašu sagatavošana
7.2.1. Difūziju agarā veic uz platēm ar četru dažādu koncentrāciju standartšķīdumiem (S8, S4, S2 un S1) un četru koncentrāciju analīzes šķīdumiem (U8, U4, U2 un U1). Šo četru dažādo koncentrāciju ekstrakta šķīdumam un standartšķīdumam noteikti jābūt uz katras plates. Šajā nolūkā izvēlas pietiekami lielas plates, uz kurām agara barotnē var izveidot vismaz astoņas 10 – 13 mm diametra iedobes, kuru centri ir vismaz 30 mm attālumā cits no cita. Testu var veikt uz plates, kas izveidota no stikla plāksnes, uz kuras uzlikts 20 mm augsts anodēta alumīnija vai plastikas riņķis ar 200 mm diametru.
7.2.2. Uz platēm lej tādu daudzumu barotnes (4.1.), kas inokulēta saskaņā ar 7.1., lai izveidotos apmēram 2 mm biezs slānis (60 ml uz plati ar 200 mm diametru). Ļauj sastingt horizontālā stāvoklī, izveido iedobes un tajās precīzi nomērītā daudzumā iepilda analizējamos šķīdumus un standartšķīdumus (no 0,10 līdz 0,15 ml uz iedobi atkarībā no diametra). Katru koncentrāciju pārbauda vismaz četras reizes, lai katrā noteikšanā novērtētu vismaz 32 inhibēšanas zonas.
7.3. Inkubācija
Plates inkubē 16 – 18 stundas 30°C temperatūrā.
8. Vērtēšana
8.1. Izmēra inhibēšanas zonu diametru ar 0,1 mm precizitāti. Uz puslogaritmiskā papīra atzīmē punktus, kas atbilst inhibēšanas zonu vidējam diametram atkarībā no koncentrācijas. Uzzīmē “atbilstošākās” līnijas attiecīgi standartšķīdumam un ekstraktam, piemēram, šādi:
8.2. Nosaka “atbilstošāko” punktu standarta zemākajam līmenim (SL) pēc formulas:
7S1 + 4S2 +
S4 – 2S8
a) SL = ––––––––––––––––––
10
8.3. Nosaka “atbilstošāko” punktu standarta augstākajam līmenim (SH) pēc formulas:
7S8 + 4S4 +
S2 – 2S1
b) SH = ––––––––––––––––––
10
8.4. Līdzīgi aprēķina “atbilstošākos” punktus ekstrakta zemākajam koncentrācijas līmenim (UL) un augstākajam līmenim (UH), norādītajās formulās S1, S2, S4 un S8 aizstājot attiecīgi ar U1, U2, U4 un U8.
8.5. Tajā pašā grafikā atzīmē aprēķinātos SL un SH lielumus, un, tos savienojot, iegūst “atbilstošāko” līniju standartšķīdumam. Līdzīgi atzīmē UH un UL, ko savienojot, iegūst “atbilstošāko” līniju ekstraktam.
8.6. Ja nav nekādu traucējošu faktoru, abām līnijām jābūt paralēlām. Praktiskos nolūkos līnijas var uzskatīt par paralēlām, ja (SH–SL) un (UH–UL) vērtības neatšķiras vairāk par 10 % no to vidējā lieluma.
8.7. Ja līnijas nav paralēlas, var atmest U1 un S1 vai U8 un S8, un SL, SH, UL un UH aprēķināt pēc alternatīvām formulām, iegūstot alternatīvas “atbilstošākās” līnijas:
5S1
+ 2S2 – S4
5S2 + 2S4 –
S8
a') SL = ––––––––––––– vai –––––––––––
6
6
5S4 + 2S2 –
S1
5S8 + 2S4 –
S2
b') SH = ––––––––––––– vai –––––––––––
6
6
un līdzīgi aprēķina UL un UH. Alternatīvo “atbilstošāko” līniju paralelitāte jāpārbauda tāpat, kā minēts iepriekš. Ja rezultāti aprēķināti pēc trim līmeņiem, to norāda beigu ziņojumā.
8.8. Ja līnijas uzskata par paralēlām, aprēķina relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) pēc vienas no šādām formulām:
8.8.1. Pēc četriem līmeņiem
(U1 + U2 +
U4 + U8 –
S1 – S2 –
S4 – S8) x 0.602
c) log A = ––––––––––––––––––––––––––––––––
U4 + U8 +
S4 + S8 – U1 –
U2 – S1 –
S2
8.8.2. Pēc trim līmeņiem:
(U1 + U2 +
U4 – S1 –
S2 – S4) x 0.401
d) log A = –––––––––––––––––––––––––––––
U4 + S4 –
U1 – S1
vai
(U2 + U4 +
U8 – S2 –
S4 – S8) x 0.401
d') log A = –––––––––––––––––––––––––––––
U8 + S8 –
U2 – S2
8.9. Faktiskā aktivitāte = pieņemtā aktivitāte x relatīvā aktivitāte.
8.10. Ja relatīvā aktivitāte neiekļaujas intervālā no 0,5 līdz 2,0, noteikšanu atkārto, attiecīgi koriģējot ekstrakta koncentrācijas, vai, ja tas nav iespējams, koriģējot standartšķīdumu koncentrācijas. Ja relatīvā aktivitāte neiekļaujas vajadzīgajās robežās, iegūtais rezultāts jāuzskata par aptuvenu, un tas jānorāda beigu ziņojumā.
8.11. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, noteikšanu atkārto. Ja paralelitāti tomēr nepanāk, noteikšana jāuzskata par neapmierinošu.
9. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
9.1. 2 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja avoparsīna saturs ir no 2 līdz 10 mg/kg;
9.2. 20 % no lielākā rezultāta, ja saturs ir no 10 līdz 25 mg/kg;
9.3. 5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja saturs ir no 25 līdz 50 mg/kg;
9.4. 10 % no lielākā rezultāta, ja saturs pārsniedz 50 mg/kg.
1 Var izmantot citas metodes, ja ir pierādīts, ka pēc tām iegūst līdzīgas baktēriju suspensijas.
2 Var lietot līdzīga sastāva standartbarotnes, ar kurām iegūst tādus pašus rezultātus.
Zemkopības ministrs M.Roze
34.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Nātrija monenzīma noteikšana ar difūzijas metodi agara barotnē
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka nātrija monenzīmu barībā un premiksos. Zemākā noteikšanas robeža ir 10 mg/kg (10 ppm) 1.
2. Princips
Paraugu ekstrahē ar 90% metilspirtu. Ekstraktam piemēro attiecīgas procedūras atkarībā no nātrija monenzīma satura paraugā. Antibiotisko aktivitāti nosaka, mērot nātrija monenzīma difūziju agara barotnē, kurā inokulēta Bacillus subtilis kultūra. Difūziju nosaka pēc mikroorganisma kavējuma zonu veidošanās. Pieņem, ka izmantoto antibiotisko vielu koncentrāciju intervālā šo zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotikas koncentrācijas logaritmam. Šīs eksperimenta sistēmas jutību samazina nātrija jonu klātbūtne.
3. Mikroorganisms: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)
3.1. Kultūras uzturēšana
Mēģenēs ar slīpagara barotni (4.1.) inokulē Bacillus subtilis un inkubē diennakti 30°C temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī apmēram 4°C temperatūrā. Katru mēnesi atkārtoti pārsēj.
3.2. Sporu suspensijas gatavošana2
Savāc augumu no svaigi sagatavotas slīpagara barotnes (3.1.) ar 2 – 3 ml sterila ūdens. Šo suspensiju inokulē 300 ml barotnes (4.1.) Rū kolbā un inkubē trīs līdz piecas dienas 30°C temperatūrā. Augumu savāc ar 15 ml 20% etilspirta (4.3.), iepriekš ar mikroskopu pārbaudot sporulāciju, un labi samaisa. Šo suspensiju var glabāt vismaz piecus mēnešus apmēram 4°C temperatūrā.
4. Barotnes un reaģenti
4.1. Barotne3
|
Triptons |
10,0 g |
|
Rauga ekstrakts |
3,0 g |
|
Gaļas ekstrakts |
1,5 g |
|
Glikoze |
1,0 g |
|
Agars (atkarībā no kvalitātes) |
10,0 – 20,0 g |
|
Ūdens |
1000 ml |
|
pH 6,5 (pēc sterilizācijas) |
|
|
4.2. Noteikšanas barotne |
|
|
Glikoze |
10,0 g |
|
Rauga ekstrakts |
2,5, g |
|
Dikālija hidrogēnfosfāts K2HPO4 |
0,69 g |
|
Kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4 |
0,45 g |
|
Agars (atkarībā no kvalitātes) |
10,0 – 20,0 g |
|
Ūdens |
1000 ml |
|
pH 6 (pēc sterilizācijas) |
4.3. Etilspirts 20 % V/V: 200 ml etilspirta atšķaida ar 800 ml ūdens
4.4. Metilspirts – bezūdens
4.5. Metilspirts 90 % (V/V): 900 ml metilspirta (4.4.) atšķaida ar 100 ml ūdens
4.6. Metilspirts 50 % (V/V): 500 ml metilspirta (4.4.) atšķaida ar 500 ml ūdens
4.7. Granulēts alumīnija oksīds (Alcoa F, 20 mesh aktivēts alumīnija oksīds UG1: F.Lancaster and Co. vai līdzvērtīgs)
4.8. Standartvielas: nātrijas monensīns ar zināmu aktivitāti, piemēram, no Starptautiskās bioloģisko standartu laboratorijas, centrālās veterinārās laboratorijas, Weybridge, UK–Surrey KT 15 3NB
5. Iekārtas
5.1. Rotācijas ietvaicētājs ar 250 ml apaļkolbu
5.2. Stikla caurule ar 25 mm lielu iekšējo diametru, 400 mm gara un ar vaļēju galu 2 mm diametrā – hromatogrāfijai
5.3. Stikla caurule ar 11 mm iekšējo diametru, apmēram 300 mm gara un ar vaļēju galu 2 mm diametrā – hromatogrāfijai
6. Standartšķīdumi
6.1. Metilspirtā (4.4.) izšķīdina precīzi nosvērtu standartvielas (4.8.) daudzumu un atšķaida, lai iegūtu izejas šķīdumu, kas satur 800 µg nātrija monensīna mililitrā. Glabājot slēgtās kolbās 4°C temperatūrā, šis šķīdums saglabā stabilitāti līdz divām nedēļām.
6.2. Šo izejas šķīdumu pakāpeniski atšķaidot ar 50 % metilspirtu (4.6.), gatavo šādus šķīdumus:
S8 8,0 µg/ml
S4 4,0 µg/ml
S2 2,0 µg/ml
S1 1,0 µg/ml
7. Ekstrakta gatavošana
7.1. Ekstrakcija:
7.1.1. Premiksi;
Nosver 2 g parauga, pievieno 100 ml 90% metilspirta (4.5.), homogenizē un dažas minūtes centrifugē. Centrifugātu atšķaida ar 50% metilspirtu (4.6.), lai iegūtu sagaidāmo nātrija monensīna saturu 8 µg/ml (= U8).
7.1.2. Barība, kurā nātrija monensīna līmenis nav zemāks par 50 ppm;
7.1.2.1. Nosver 10 – 20 g parauga, pievieno 100 ml 90% metilspirta (4.5.), 15 minūtes homogenizē un ļauj nostāties.
7.1.2.2. Ieliek kokvilnas vates tamponu stikla caurules (5.2.) šaurajā galā un pievieno alumīnija oksīdu (4.7.), maigi piedauzot, līdz kolonna sasniedz 75 – 80 mm augstumu.
7.1.2.3. Dekantē ekstraktu uz alumīnija oksīda kolonnas un savāc filtrātu. Atšķaida 30 ml filtrāta līdz 50 ml ar ūdeni. Pakāpeniski atšķaida ar 50% metilspirtu (4.6.), lai iegūtu sagaidāmo nātrija monensīna saturu 8 µg/ml (= U8).
7.1.3. Barība, kurā nātrija monensīna līmenis ir zemāks par 50 ppm (līdz 10 ppm robežai).
7.1.3.1. Nosver 10 – 20 g parauga, pievieno 100 ml 90% metilspirta (4.5.), 15 minūtes homogenizē. Centrifugē, līdz kļūst dzidrs.
7.1.3.2. Paraugam, kas satur 20 ppm nātrija monensīna, ņem 40 ml centrifugāta. Paraugam, kas satur 10 ppm, ņem 80 ml, un ar rotācijas ietvaicētāju (5.1.) vakuumā ietvaicē līdz sausam temperatūrā, kas nepārsniedz 40°C. Sauso atlikumu izšķīdina 10 ml 90% metilspirta (4.5.).
7.1.3.3. Ieliek kokvilnas vates tamponu stikla caurules (5.3.) šaurajā galā un pievieno alumīnija oksīdu (4.7.), maigi piedauzot, līdz kolonna sasniedz 75 – 80 mm augstumu.
7.1.3.4. Dekantē sausā atlikuma metilspirta šķīdumu uz alumīnija oksīda kolonnas un savāc filtrātu. Mazgā kolonnu ar 10 ml 90% metilspirta (4.5.) un apvieno iztecējušo šķīdumu ar filtrātu.
7.1.3.5. Vakuumā un temperatūrā, kas ir zemāka par 40°C, ar rotācijas ietvaicētāju (5.1.) šķīdumu ietvaicē līdz sausam. Sauso atlikumu izšķīdina 10 ml bezūdens metilspirta (4.4.) un uzpilda līdz 20 ml ar ūdeni. Šķīdumu vismaz piecas minūtes centrifugē ar ātrumu, kas nav mazāks par 4000 apgriezieniem minūtē. Pakāpeniski atšķaida ar 50% metilspirtu (4.6.), lai iegūtu sagaidāmo nātrija monensīna saturu 8 µg/ml (= U8).
7.2. Analizējamie šķīdumi
Šķīdumu U8 pakāpeniski atšķaidot (1 + 1) ar 50% metilspirtu (4.6.), gatavo šķīdumu U4 (sagaidāmais saturs: 4 µg/ml), U2 (sagaidāmais saturs 2 µg/ml) un U1 (sagaidāmais saturs 1 µg/ml) .
8. Noteikšanas metode
8.1. Inokulēšana barotnē
Sporu suspensiju (3.2.) 50 – 60°C temperatūrā inokulē barotnē (4.2.). Priekšmēģinājumos uz platēm ar barotni (4.2.) nosaka, kāds sporu suspensijas daudzums ir vajadzīgs, lai ar dažādo koncentrāciju nātrija monensīna iegūtu lielākās un skaidrākās kavējuma zonas.
8.2. Plašu sagatavošana
8.2.1. Difūziju agarā veic uz platēm ar četru dažādu koncentrāciju standartšķīdumiem (S8, S4, S2 un S1) un četru koncentrāciju analizējamajiem šķīdumiem (U8, U4, U2 un U1). Šo četru dažādo koncentrāciju ekstrakta šķīdumam un standartšķīdumam noteikti jābūt uz katras plates. Šajā nolūkā izvēlas pietiekami lielas plates, uz kurām agara barotnē var izveidot vismaz astoņas 10 – 13 mm diametra iedobes, kuru centri ir vismaz 30 mm attālumā cits no cita. Testu var veikt uz plates, kas izveidota no stikla plāksnes, uz kuras uzlikts 20 mm augsts anodēta alumīnija vai plastikas riņķis ar 200 mm diametru.
8.2.2. Uz platēm lej tādu daudzumu barotnes (4.2.), kas inokulēta saskaņā ar 8.1., lai izveidojas apmēram 2 mm biezs slānis (60 ml uz plati, kuras diametrs ir 200 mm). Ļauj sastingt horizontālā stāvoklī, izveido iedobes un tajās precīzi nomērītā daudzumā iepilda analizējamo šķīdumu un standartšķīdumu (no 0,10 līdz 0,15 ml uz iedobi atkarībā no diametra). Katru koncentrāciju pārbauda vismaz četras reizes, lai katrā noteikšanā novērtētu vismaz 32 kavējuma zonas.
8.3. Inkubācija
Plates inkubē apmēram 18 stundas 35 – 37°C temperatūrā.
9. Vērtēšana
9.1. Izmēra kavējuma zonu diametru ar 0,1 mm precizitāti. Katrai koncentrācijai atbilstīgo vidējo mērījumu atzīmē uz puslogaritmiskā papīra, parādot koncentrāciju logaritmu attiecībā pret inhibēšanas zonu diametriem. Uzzīmē “atbilstošākās” līnijas attiecīgi standartšķīdumam un ekstraktam, piemēram, šādi:
9.2. Nosaka “atbilstošāko” punktu standarta zemākajam līmenim (SL) pēc formulas:
7S1 + 4S2 +
S4 – 2S8
a) SL = ––––––––––––––––––
10
9.3. Nosaka “atbilstošāko” punktu standarta augstākajam līmenim (SH) pēc formulas:
7S8 + 4S4 +
S2 – 2S1
b) SH = ––––––––––––––––––
10
9.4. Līdzīgi aprēķina “atbilstošākos” punktus ekstrakta zemākajam koncentrācijas līmenim (UL) un augstākajam līmenim (UH), norādītajās formulās S1, S2, S4 un S8 aizstājot attiecīgi ar U1, U2, U4 un U8.
9.5. Uz tā paša puslogaritmiskā papīra atzīmē aprēķinātos SL un SH lielumus, un, tos savienojot, iegūst “atbilstošāko” līniju standartšķīdumam. Līdzīgi atzīmē UH un UL, ko savienojot, iegūst “atbilstošāko” līniju ekstraktam.
9.6. Ja nav nekādu traucējošu faktoru, abām līnijām jābūt paralēlām. Praktiskos nolūkos līnijas var uzskatīt par paralēlām, ja (SH–SL) un (UH–UL) vērtības neatšķiras vairāk par 10 % no to vidējā lieluma.
9.7. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, var atmest U1 un S1 vai U8 un S8, un SL, SH, UL un UH aprēķināt pēc alternatīvām formulām, iegūstot alternatīvas “atbilstošākās” līnijas:
5S1 + 2S2 –
S4
5S2 + 2S4 –
S8
a') SL = ––––––––––––– vai –––––––––––
6
6
5S4 + 2S2 – S1
5S8 + 2S4 –
S2
b') SH = ––––––––––––– vai –––––––––––
6
6
9.8. Alternatīvo “atbilstošāko” līniju paralelitāti jāpārbauda tāpat kā iepriekš. Ja rezultāti aprēķināti pēc trim līmeņiem, tas būtu jānorāda nobeiguma ziņojumā.
9.9. Ja līnijas uzskata par paralēlām, aprēķina relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) pēc vienas no formulām:
9.9.1. Pēc četriem līmeņiem
(U1 + U2 +
U4 + U8 –
S1 – S2 –
S4 – S8) x 0.602
c) log A = ––––––––––––––––––––––––––––––––
U4 + U8 +
S4 + S8 – U1 –
U2 – S1 –
S2
9.9.2. Pēc trim līmeņiem
(U1 + U2 +
U4 – S1 –
S2 – S4) x 0.401
d) log A = –––––––––––––––––––––––––––––
U4 + S4 –
U1 – S1
vai
(U2 + U4 +
U8 – S2 –
S4 – S8) x 0.401
d') log A = –––––––––––––––––––––––––––––
U8 + S8 –
U2 – S2
9.10. Faktiskā aktivitāte = pieņemtā aktivitāte x relatīvā aktivitāte.
9.11. Ja relatīvā aktivitāte neiekļaujas intervālā no 0,5 līdz 2,0, eksperimentu atkārto, attiecīgi koriģējot ekstrakta koncentrācijas, vai, ja tas nav iespējams, koriģējot standartšķīduma koncentrācijas. Ja relatīvo aktivitāti nevar iekļaut vajadzīgajās robežās, jebkurš iegūtais rezultāts jāuzskata par aptuvenu, un tas jānorāda nobeiguma ziņojumā.
9.12. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, noteikšanu atkārto. Ja paralelitāti tomēr nepanāk, noteikšana jāuzskata par neapmierinošu.
10. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
10.1. 20 % no lielākā rezultāta, ja nātrija monensīna saturs ir no 10 līdz 25 mg/kg;
10.2. 5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja nātrija monensīna saturs ir no 25 līdz 50 mg/kg;
10.3. 10 % no lielākā rezultāta, ja saturs pārsniedz 50 mg/kg.
1 1 mg nātrija monensīna atbilst 1 000 UK vienībām.
2 Var izmantot citas metodes, ja ir pierādīts, ka pēc tām iegūst līdzīgas sporu suspensijas.
3 Var izmantot līdzīga sastāva komerciālās barotnes, ar kurām iegūst tādus pašus rezultātus.
Zemkopības ministrs M.Roze
35.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Spiramicīna noteikšana ar difūzijas metodi agara barotnē
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka spiramicīnu barībā un premiksos. Zemākā noteikšanas robeža ir 1 mg/kg (1 ppm)1.
2. Princips
Paraugu ekstrahē ar metilspirta, fosfāta–bikarbonāta buferšķīduma maisījumu pH 8. Ekstraktu dekantē vai centrifugē un atšķaida. Tā antibiotisko aktivitāti nosaka, mērot spiramicīna difūziju agara barotnē, kurā inokulēts Micrococcus luteus. Difūziju parāda mikroorganisma inhibēšanas zonu veidošanās. Minēto zonu diametru pieņem par tieši proporcionālu antibiotikas koncentrācijas logaritmam izmantotajā antibiotikas koncentrācijas intervālā.
3. Mikroorganisms: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553).
3.1. Izejas kultūras uzturēšana
Mēģenēs uz slīpagara (4.1.) uzsēj Micrococcus luteus un 24 stundas inkubē 30°C temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī apmēram 4°C temperatūrā. Atkārtotu pārsēšanu veic reizi divās nedēļās.
3.2. Baktēriju suspensijas gatavošana a
No svaigi pagatavota slīpagara (3.1.) ar 2 – 3 ml nātrija hlorīda šķīduma (4.3.) savāc kultūras augumu. Šo suspensiju iesēj Rū (Roux) kolbā , kas satur 250 ml barotnes (4.1.), un inkubē 18 līdz 20 stundas 30°C temperatūrā. Augumu savāc ar 25 ml nātrija hlorīda šķīduma (4.3.) un samaisa. Suspensiju atšķaida ar nātrija hlorīda šķīdumu (4.3.) attiecībā 1:10. Suspensijas gaismas caurlaidībai jābūt apmēram 75%, mērot 650 nm 1 cm kivetē pret nātrija hlorīda šķīdumu (4.3.). Šo suspensiju var glabāt vienu nedēļu apmēram 4°C temperatūrā.
4. Barotnes un reaģenti
|
4.1. Barotne b |
|
|
Gaļas peptons |
6,0 g |
|
Triptons |
4,0 g |
|
Rauga ekstrakts |
3,0 g |
|
Gaļas ekstrakts |
1,5 g |
|
Glikoze |
1,0 g |
|
Agars |
no 10,0 līdz 20,0 g |
|
Ūdens |
1000 ml |
|
pH no 6,5 līdz 6,6 (pēc sterilizācijas) |
|
|
4.2. Noteikšanas vide b |
|
|
Triptons |
5,0 g |
|
Rauga ekstrakts |
4,0 g |
|
Gaļas ekstrakts |
3,0 g |
|
Agars |
no 10,0 līdz 20,0 g |
|
Ūdens |
1000 ml |
|
pH 8,0 (pēc sterilizācijas). |
|
4.3. Nātrija hlorīda šķīdums 0,8 % (m/V)
8g nātrija hlorīda izšķīdina ūdenī un atšķaida līdz 1000 ml, sterilizē
4.4. Fosfāta–bikarbonāta buferšķīdums ar pH 8,0
16,7 g kālija hidrogēnfosfāts K2HPO4
0,5 g kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4
20,0 g nātrija hidrogēnkarbonāts NaHCO3
Ūdens līdz 1000 ml
4.5. Metilspirta, fosfāta–bikarbonāta buferšķīduma maisījums (4.4.) 50:50 (V/V)
4.6. Standartviela
Spirimicīns ar zināmu aktivitāti (SV)
5. Standartšķīdumi
5.1. Precīzi nosvērtu standartvielas (4.6.) daudzumu izšķīdina maisījumā (4.5.) un atšķaida ar to pašu maisījumu, lai iegūtu izejas šķīdumu, kura spirimicīna saturs ir 1000 SV mililitrā. Šo šķīdumu noslēgtā kolbā 4°C temperatūrā var glabāt ne ilgāk par piecām dienām.
5.2. No šā izejas šķīduma, pakāpeniski atšķaidot ar maisījumu (4.5.), gatavo šādus šķīdumus:
S8 1 SV/ml
S4 0,5 SV/ml
S2 0,25 SV/ml
S1 0,125 SV/ml
6. Ekstrakta un noteikšanas šķīduma gatavošana
6.1. Ekstrakcija
6.1.1. barības analīzes paraugam nosver 20,0 g barības, bet premiksu analīzes paraugam – no 1,0 līdz 20,0 g premiksu. Pievieno 100 ml maisījuma (4.5.) un krata 30 minūtes. Centrifugē vai dekantē un atšķaida centrifugātu ar maisījumu (4.5.), lai iegūtu paredzamo spirimicīna saturu 1 SV/ml (= U8).
6.1.2. Ja paredzamais spirimicīna saturs barībā ir mazāks par 2,5 mg/kg, ekstrakcija jāveic šādi: paraugam nosver 20,0 g barības. Pievieno 100 ml maisījuma (4.5.) un krata 30 minūtes. Centrifugē dažas minūtes, ņem 50 ml centrifugāta un ietvaicē rotācijas ietvaicētājā apmēram līdz 4 ml pie samazināta spiediena, temperatūrā, kas nepārsniedz 40°C. Atšķaida atlikumu ar maisījumu (4.5.), lai iegūtu paredzamo spirimicīna saturu 1 SV/ml (= U8).
6.2. Analizējamie šķīdumi
No šķīduma U8, pakāpeniski atšķaidot (1 + 1) ar maisījumu (4.5.), gatavo šķīdumu U4 (paredzamais saturs – 0,5 SV/ml), U2 (paredzamais saturs – 0,25 SV/ml) un U1 (paredzamais saturs – 0,125 SV/ml).
7. Noteikšanas norise
7.1. Inokulēšana barotnē
Baktēriju suspensijas (3.2.) inokulēšanu pamatbarotnē (4.2.) veic apmēram 50°C temperatūrā. Priekšmēģinājumos uz platēm ar barotni (4.2.) nosaka baktēriju suspensijas daudzumu, kāds vajadzīgs, lai ar dažādu koncentrāciju spirimicīnu iegūtu lielākās un skaidrākās inhibēšanas zonas.
7.2. Plašu gatavošana
7.2.1. Difūziju agarā veic uz platēm, lietojot četru koncentrāciju standartšķīdumus (S8, S4, S2, S1) un četru koncentrāciju analizējamos šķīdumus (U8, U4, U2, U1). Uz katras plates obligāti jābūt minēto četru koncentrāciju ekstraktam un standartšķīdumam. Šim nolūkam izvēlas plates, kas ir pietiekami lielas, lai agara barotnē var izveidot vismaz astoņas iedobes ar diametru no 10 līdz 13 mm, atstājot ne mazāk kā 30 mm starp to centriem. Testu var veikt uz platēm, kas sastāv no stikla loksnes un 200 mm diametra un 20 mm augsta anodēta alumīnija vai plastikas riņķa uz tās.
7.2.2.Uz platēm lej tādu daudzumu barotnes (4.2.), ko inokulē, kā noteikts 7.1.apakšpunktā, lai izveidojas apmēram 2mm biezs slānis (60 ml uz 200 mm diametra plates). Ļauj tam sastingt horizontālā stāvoklī, izurbj iedobes un tajās iepilda precīzi nomērītus analizējamā šķīduma un standartšķīduma daudzumus (no 0,10 līdz 0,15 ml katrā iedobē – atbilstoši diametram). Katru koncentrāciju uznes vismaz četras reizes, lai katrā noteikšanā novērtētu 32 inhibēšanas zonas.
7.3. Inkubācija
Plates inkubē 16 līdz 18 stundas 30 ± 2°C temperatūrā.
8. Novērtējums
8.1. Ar 0,1 mm precizitāti izmēra inhibēšanas zonu diametru. Katrai koncentrācijai atbilstošos vidējos mērījumus pieraksta uz puslogaritmiskā papīra, parādot koncentrāciju logaritmu attiecībā pret inhibēšanas zonu diametriem. Novelk standartšķīduma un ekstrakta “atbilstošākās” taisnes, piemēram, kā parādīts tālāk tekstā:
8.2. “Atbilstošāko” punktu standarta zemākajam līmenim (SL) nosaka pēc formulas:
7s1 + 4s2 +
s4 – 2s8
a) SL = ––––––––––––––––––
10
8.3. “Atbilstošāko” punktu standarta augstākajam līmenim (SH) nosaka pēc formulas:
7s8 + 4s4 +
s2 – 2s1
b) SH = ––––––––––––––––––
10
8.4. Līdzīgi aprēķina “atbilstošākos” punktus ekstrakta zemākajam līmenim (UL) un ekstrakta augstākajam līmenim (UH), iepriekšminētajās formulās 1 attiecīgi s1, s2, s4 un s8 aizstājot ar u1, u2, u4 un u8.
8.5. Aprēķinātās SL un SH vērtības atzīmē uz tā paša puslogaritmiskā papīra un savieno, lai iegūtu standartšķīduma “atbilstošāko” līniju. Līdzīgi atzīmē un savieno UL un UH, lai iegūtu ekstrakta “atbilstošāko” līniju.
8.6. Ja nav nobīdes, līnijām vajadzētu būt paralēlām. Praktiskām vajadzībām līnijas var uzskatīt par paralēlām, ja lielumu (SH – SL) un (UH – UL) vērtība nepārsniedz 10 % no to vidējās vērtības.
8.7. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, u1 un s1 vai u8 un s8 var atmest, un, lai iegūtu alternatīvas “atbilstošākās” līnijas, SL, SH, UL un UH aprēķināt pēc alternatīvām formulām:
5s1 + 2s2 –
s4
5s2 + 2s4 –
s8
a') SL = ––––––––––––– vai –––––––––––
6
6
5s4 + 2s2 –
s1
5s8 + 2s4 –
s2
b') SH = ––––––––––––– vai –––––––––––
6
6
un līdzīgi aprēķināt UL un UH. Jāievēro tie paši paralelitātes kritēriji. Nobeiguma ziņojumā būtu jānorāda, ka rezultāts ir aprēķināts no trim līmeņiem.
1 Mazie burti “s” un “u” attiecas uz inhibēšanas zonu diametriem
8.8. Ja līnijas uzskata par paralēlām, aprēķina relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) pēc vienas no šādām formulām atkarībā no tā, vai paralelitātes novērtējumā ir izmantoti trīs vai četri līmeņi.
8.8.1. Četru līmeņu gadījumā
(u1 + u2 +
u4 + u8 –
S1 – S2 –
S4 – S8) x 0.602
c) log A = ––––––––––––––––––––––––––––––––
u4 + u8 +
S4 + S8 – u1 –
u2 – S1 –
S2
8.8.2. Triju līmeņu gadījumā
(u1 + u2 +
u4 – S1 –
S2 – S4) x 0.401
d) log A = –––––––––––––––––––––––––––––
u4 + S4 –
u1 – S1
vai
(u2 + u4 +
u8 – S2 –
S4 – S8) x 0.401
d') log A = –––––––––––––––––––––––––––––
u8 + S8 –
u2 – S2
8.9. Parauga ekstrakta aktivitāte = attiecīgā standarta aktivitāte x A
(U8 = S8 x A)
8.10. Ja relatīvā aktivitāte ir ārpus intervāla no 0,5 līdz 2,0, noteikšanu atkārto, veicot nepieciešamās ekstrakta koncentrāciju korekcijas vai, ja tas nav iespējams, standartšķīdumu koncentrāciju korekcijas. Ja relatīvo aktivitāti neizdodas iekļaut attiecīgajā intervālā, jebkurš iegūtais rezultāts jāuzskata par aptuvenu, un tas jānorāda beigu ziņojumā.
8.11. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, noteikšanu atkārto. Ja tomēr nepanāk paralelitāti, noteikšana jāuzskata par neapmierinošu.
8.12. Rezultātu izsaka spirimicīna bāzes miligramos uz barības kilogramu.
9. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt:
9.1. 2 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja spirimicīna bāzes saturs ir līdz 10 mg/kg;
9.2. 20 % no augstākā lieluma, ja saturs ir no 10 līdz 25 mg/kg;
9.3. 5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja saturs ir no 25 līdz 50 mg/kg;
9.4. 10 % no augstākā lieluma, ja saturs ir virs 50 mg/kg.
11 mg spirimicīna bāzes atbilst 3200 starptautiskajām vienībām (SV).
a Var lietot citas metodes, ja ir noskaidrots, ka ar tām iegūst līdzīgas baktēriju suspensijas.
b Var lietot jebkuru citu komerciālo barotni ar līdzīgu sastāvu, kura dod tādus pašus rezultātus.
Zemkopības ministrs M.Roze
36.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Halofuginona noteikšana
DL-trans-7-brom-6-hlor-3-[3-(3-hidroksi-2-piperidil)acetonil]-hinazolīn-4-(3H)-ona hidrobromīds
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka halofuginonu barībā. Zemākā noteikšanas robeža ir 1 mg/kg.
2. Princips
Pēc apstrādes ar karstu ūdeni halofuginonu brīvas bāzes veidā ekstrahē etilacetātā, pēc tam skābes ūdens šķīdumā hidrohlorīda veidā. Ekstraktu attīra ar jonu apmaiņas hromatogrāfijas metodi.
Halofuginona saturu nosaka ar apgrieztās fāzes augsti efektīvo šķidruma hromatogrāfiju (AEŠH), lietojot UV detektoru.
3. Reaģenti
3.1. Acetonnitrils – AEŠH kvalitātes
3.2. Jonapmaiņas sveķi – Amberlite XAD–2
3.3. Amonija acetāts
3.4. Etilacetāts
3.5. Ledus etiķskābe
3.6. Halofuginona standartviela – DL–trans–7–brom–6–hlor–3–[3–(3–hidroksi–2–piperidil) acetonil]–hinazolīn–4–(3H)–ona hidrobromīds, E 764:
3.6.1. Halofuginona izejas standartšķīdums – 100 µg/ml;
Iesver 50 mg halofuginona (3.6.) ar precizitāti līdz 0,1 mg 500 ml mērkolbā, izšķīdina amonija acetāta buferšķīdumā (3.18.), kolbu uzpilda līdz atzīmei ar buferškīdumu un samaisa. Glabājot tumsā, 50C temperatūrā, šķīdums ir stabils trīs nedēļas;
3.6.2. Kalibrēšanas šķīdumi;
Attiecīgi 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 un 6,0 ml izejas standartšķīduma (3.6.1.) pārnes uz 100ml mērkolbu sēriju. Uzpilda līdz atzīmei ar kustīgo fāzi (3.21.) un samaisa. Šajos šķīdumos halofuginona koncentrācija attiecīgi ir 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 un 6,0 µg/ml. Šie šķīdumi jāsagatavo tieši pirms lietošanas.
3.7. Sālsskābe (20 aptuveni 1,16 g/ml)
3.8. Metanols
3.9. Sudraba nitrāts
3.10. Nātrija askorbāts
3.11. Nātrija karbonāts
3.12. Nātrija hlorīds
3.13. EDTA (etilēndiamīntetraetiķskābes dinātrija sāls)
3.14. Ūdens – AEŠH kvalitātes
3.15. Nātrija karbonāta šķīdums – v = 10 g/100 ml
3.16. Nātrija hlorīda – piesātināta nātrija karbonāta šķīdums – v = 5 g/100 ml. Ūdenī izšķīdina 50 g nātrija karbonāta (3.11.), atšķaida līdz 1 litra tilpumam un pievieno nātrija hlorīdu (3.12.) līdz šķīdums piesātinās.
3.17. Sālsskābe – aptuveni 0,1 mol/l – atšķaida 10 ml sālsskābes (3.7.) ar ūdeni līdz 1 litram
3.18. Amonija acetāta buferšķīdums, aptuveni 0,25 mol/l – izšķīdina 19,3 g amonija acetāta (3.3.) un 30 ml ledus etiķskābes (3.5.) ūdenī (3.14.) un atšķaida līdz 1 litram
3.19. Jonapmaiņas sveķu Amberlite XAD–2 sagatavošana
Amberlitu (3.2.) mazgā ar pietiekamu daudzumu ūdens, līdz aizskaloti visi hlorīdjoni, par ko liecina nolietā ūdens pārbaude ar sudraba nitrātu (3.20.). Pēc tam sveķus mazgā ar 50 ml metanola (3.8.), metanolu izlej un sveķus glabā zem svaiga metanola.
3.20. Sudraba nitrāta šķīdums – aptuveni 0,1 mol/l – izšķīdina 0,17 g sudraba nitrāta (3.9.) 10 ml ūdens
3.21. AEŠH kustīgā fāze – samaisa 500 ml acetonitrila (3.1.) ar 300 ml amonija acetāta buferšķīduma (3.18.) un 1200 ml ūdens (3.14.). Ar etiķskābi (3.5.) noregulē pH uz 4,3. Filtrē caur 0,22 µm filtru (4.8.) un šķīdumu degazē (piemēram, apstrādā ar ultraskaņu 10 min.). Glabājot slēgtā traukā tumšā vietā, šķīdums ir stabils 1 mēnesi.
4. Aparatūra
4.1. Ultraskaņas vanna
4.2. Rotācijas ietvaicētājs
4.3. Centrifūga
4.4. AEŠH iekārta, kurai ir ultravioletais detektors ar maināmu viļņu garumu vai diodu matricas detektors. Šķidrumu hromatogrāfijas kolonna: 300 mm x 4 mm, C18, 10 µm pildījuma daļiņas vai līdzvērtīga.
4.5. Stikla kolonna (300 mm x 10 mm) ar poraina stikla filtru un krānu
4.6. Stiklašķiedras filtrpapīrs – diametrs 150 mm
4.7. Membrānas filtri – 0,45 µm
4.8. Membrānas filtri – 0,22 µm
5. Procedūra
Piezīme: halofuginons brīvas bāzes veidā ir nestabils sārmainos un etilacetāta šķīdumos. Tas nedrīkst palikt etilacetātā ilgāk par 30 minūtēm.
5.1. Vispārīgi noteikumi:
5.1.1. Jāanalizē barības tukšais paraugs, lai pārbaudītu, ka paraugā nav halofuginona vai traucējošu vielu;
5.1.2. Atgūstamības tests jāveic, analizējot barības tukšo paraugu, kuram ir pievienots tāds daudzums halofuginona, kas ir līdzīgs paraugā esošajam. Lai pievienotu piedevu 3 mg/kg: 10 g barības tukšā parauga pievieno 300 µl izejas standartšķīduma (3.6.1.), sajauc un pirms ekstrakcijas uzsākšanas (5.2.) atstāj uz 10 minūtēm.
Piezīme: lietojot šo metodi, par tukšo paraugu vajadzētu izmantot tāda paša tipa barību, kāda ir analizējamā paraugā, un pārbaudēs nevajadzētu tikt konstatētam halofuginonam.
5.2. Ekstrakcija
5.2.1. 200 ml centrifūgas stobriņā nosver 10 g sagatavotā parauga ar precizitāti līdz 0,1 g, pievieno 0,5 g nātrija askorbāta (3.10.), 0,5 g EDTA (3.13.) un 20 ml ūdens, samaisa. Stobriņu uz 10 minūtēm ieliek ūdens vannā (800C). Pēc atdzesēšanas līdz istabas temperatūrai pievieno 20 ml nātrija karbonāta šķīduma (3.15.) un samaisa. Nekavējoties pievieno 100 ml etilacetāta (3.4.) un ar roku intensīvi krata 15 sekundes. Stobriņu bez vāciņa uz 3 minūtēm ieliek ultraskaņas vannā (4.1.). Centrifugē 2 minūtes, un etilacetāta fāzi caur stikla šķiedras filtru (4.6.)dekantē 500 ml dalāmā piltuvē. Atkārto parauga ekstrakciju ar otru 100 ml etilacetāta porciju. Ar 50 ml nātrija hlorīda – piesātināta nātrija karbonāta (3.16.) mazgā apvienotos ekstraktus 1 minūti, ūdens slāni izlej.
5.2.2. Organisko slāni 1 minūti ekstrahē ar 50 ml sālsskābes (3.17.). Skābes (apakšējo) slāni pārnes 250 ml dalāmā piltuvē. Organisko slāni pusotru minūti atkārtoti ekstrahē ar nākamajiem 50 ml sālsskābes un apvieno ar pirmo ekstraktu. Apvienotos skābes ekstraktus, maisot 10 sekundes, mazgā ar 10 ml etilacetāta (3.4.).
5.2.3. Ūdens slāni kvantitatīvi pārnes uz 250 ml apaļkolbu un aizvāc organisko fāzi. No skābes šķīduma etilacetāta atliekas iztvaicē rotācijas ietvaicētājā (2.4.). Ūdens vannas temperatūra nedrīkst pārsniegt 400C. Vakuumā aptuveni 25 mbar visu atlieku etilacetātu aizdestilē 5 minūšu laikā 380C temperatūrā.
5.3. Attīrīšana:
5.3.1. Amberlita kolonnas gatavošana;
Katram parauga ekstraktam sagatavo XAD–2 kolonnu.Stikla kolonnā (4.5.) ar metanolu (3.8.) pārnes 10 g sagatavota Amberlita (3.19.).Virs sveķu slāņa uzliek nelielu stikla vates tamponiņu. Metanolu no kolonnas izlej un sveķus mazgā ar 100 ml ūdens, plūsmu aptur, līdz šķidrums sasniedz sveķu virsmu. Pirms parauga attīrīšanas kolonnai ļauj 10 minūtes līdzsvaroties. Nekad nepieļauj kolonnai iztecēt sausai.
5.3.2. Parauga attīrīšana;
Ekstraktu (5.2.) kvantitatīvi pārnes uz sagatavoto Amberlita kolonnu (5.3.1.) un eluē, eluātu izlej. Eluēšanas ātrums nedrīkst pārsniegt 20 ml/min. Ar 20 ml sālsskābes (3.17.) izskalo apaļkolbu un ar šo šķīdumu mazgā sveķu kolonnu. Ar gaisa plūsmu izpūš ārā skābes atlikumu. Iztecējušo mazgāšanas šķīdumu izlej. Kolonnā ielej 100 ml metanola (3.8.), ļauj 5–10 ml eluēties, eluātu savāc 250 ml apaļkolbā. Sveķiem 10 minūtes ļauj līdzsvaroties ar atlikušo metanolu un turpina eluēšanu ātrumā, kas nepārsniedz 20 ml/min., eluātu savāc tai pašā 250 ml apaļkolbā. Rotācijas ietvaicētājā iztvaicē metanolu, ūdens vannas temperatūra nedrīkst pārsniegt 400C. Ar kustīgo fāzi (3.21.) atlikumu kvantitatīvi pārnes 10 ml mērkolbā. Ar kustīgo fāzi uzpilda līdz atzīmei un samaisa. Alikvotu daļu filtrē caur membrānfiltru (4.7.). Veic AEŠH analīzi (5.4.).
5.4. Noteikšana ar AEŠH:
5.4.1.1. Parametri;
Ieteicams ievērot šādus nosacījumus:
Šķidruma hromatogrāfa kolonna (4.4.1.);
AEŠH kustīgā fāze (3.21.);
Plūsmas ātrums: 1,5 līdz 2 ml/minūtē;
Detektora viļņu garums: 243 nm;
Ievadīšanas tilpums: 40 līdz 100 µl.
5.4.1.2. Pārbauda hromatogrāfijas sistēmas stabilitāti, vairākas reizes iešļircinot kalibrēšanas šķīdumu (3.6.2.), kas satur 3,0 µg/ml, līdz sasniedz nemainīgu smaiļu augstumu (laukumu) un aiztures laiku. Var strādāt citos apstākļos, ja tie dod līdzvērtīgus rezultātus.
5.4.2. Kalibrēšanas grafiks;
Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.6.2.) iešļircina vairākas reizes un izmēra katrai koncentrācijai atbilstošos smaiļu augstumus (laukumus). Uzzīmē kalibrācijas grafiku, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu vidējos smaiļu augstumus vai laukumus un uz abscisu ass – atbilstošās koncentrācijas µg/ml.
5.4.3. Parauga šķīdums;
Iešļircina parauga ekstraktu (5.3.2.) vairākas reizes, ņemot tādu pašu tilpumu kā kalibrēšanas šķīdumiem, un nosaka halofuginona smaiļu vidējo augstumu (laukumu).
6. Rezultātu aprēķināšana
6.1. Nosaka parauga šķīduma koncentrāciju µg/ml pēc halofuginona smaiļu vidējā augstuma (laukuma) parauga šķīdumā, salīdzinot ar kalibrēšanas grafiku (5.4.2.).
6.2. Halofuginona saturu w (mg/kg) analizējamā paraugā aprēķina pēc šādas formulas:
c x
10
w = ––––––,
m
kur:
c= halofuginona koncentrācija parauga šķīdumā µg/ml;
m = analizējamā parauga masa gramos.
7. Rezultātu izvērtējums
7.1. Identifikācija:
Nosakāmā komponenta identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskā noteikšanā vai lietojot diodu matricas detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta spektru ar tā kalibrēšanas šķīduma (3.6.2.) spektru, kurš satur 6,0 µg/ml halofuginona.
7.1.1. Paralēla hromatogrāfiskā noteikšana;
7.1.1.1. Parauga ekstraktam pievieno piedevu, pielejot attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.6.2.). Pievienotā halofuginona daudzumam jābūt līdzīgam aprēķinātajam parauga ekstraktā atrastajam halofuginona daudzumam.
7.1.1.2. Tikai halofuginona smailes augstumam būtu jāpalielinās, ņemot vērā pievienoto daudzumu un ekstrakta atšķaidījumu. Smailes platumam vietā, kas ir puse no tās maksimālā augstuma, jābūt apmēram 10% robežās no bezpiedevas smailes attiecīgā platuma.
7.1.2. Noteikšana ar diodu matricas detektoru;
Rezultātus vērtē pēc šādiem kritērijiem:
a) parauga maksimālās absorbcijas un standartspektra viļņu garumiem, ko reģistrē pīķa virsotnē hromatogrammā, jābūt vienādiem detektora sistēmas izšķirtspējas noteiktās robežās. Diodu matricas detektoram šīs robežas parasti ir apmēram 2 nm;
b) paraugs un standartspektri, kas reģistrēti hromatogrammas smailes virsotnē, ir starp 225 un 300 nm, tie nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kas ir no 10 līdz 100% relatīvās absorbcijas diapazonā. Atbilstība šim kritērijam ir panākta, ja maksimumi sakrīt un nevienā novērojamā punktā novirze starp abiem spektriem nepārsniedz 15% no nosakāmā standarta komponenta absorbcijas;
c) starp 225 un 300 nm parauga ekstrakta smailes kāpuma virsotnes un krituma spektri cits no cita nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kas ir 10 līdz 100% relatīvās absorbcijas diapazonā. Atbilstība šim kritērijam ir panākta, ja maksimumi sakrīt un nevienā novērojamā punktā novirze starp spektriem nepārsniedz 15% no smailes virsotnes spektra absorbcijas.
Ja nav atbilstības kaut vienam no šiem kritērijiem, nosakāmā komponenta klātbūtne nav apstiprināta.
7.2. Atkārtojamība
Atšķirība starp diviem vienam un tam pašam paraugam paralēli veiktiem noteikšanas rezultātiem nedrīkst pārsniegt 0,5 mg/kg, ja halofuginona saturs ir līdz 3 mg/kg.
7.3. Atgūstamība
Tukšā parauga ar piedevu atgūstamībai vajadzētu būt vismaz 80%.
8. Salīdzinošās testēšanas rezultāti
Tika organizēta starplaboratoriju salīdzinošā testēšana1, kurā 8 laboratorijās analizēja trīs paraugus.
Rezultāti
Tabulas : skatīt OJ
1 The Analyst 108, 1983, pp. 1252–1256.
Zemkopības ministrs M.Roze
37.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Robenidīna noteikšana
1,3-bis[(4-hlorbenzilidēn)amino] guanidīna hidrohlorīds
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka robenidīnu barībā. Zemākā noteikšanas robeža ir 5 mg/kg.
2. Princips
Paraugu ekstrahē ar paskābinātu metanolu. Ekstraktu žāvē un alikvotu daļu attīra uz alumīnija oksīda kolonnas. Robenidīnu no kolonnas eluē ar metanolu, koncentrē un uzpilda līdz attiecīgam tilpumam ar kustīgo fāzi. Robenidīna saturu nosaka ar apgrieztās fāzes augsti efektīvo šķidruma hromatogrāfiju (AEŠH), lietojot UV detektoru.
3. Reaģenti
3.1. Metanols
3.2. Paskābināts metanols
4,0 ml sālsskābes (1,18 g/ml) iepilda 500 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar metanolu (3.1.) un sajauc. Šis šķīdums jāgatavo tieši pirms lietošanas.
3.3. AEŠH kvalitātes acetonitrils
3.4. Molekulārais siets
3A tips, graudiņi 8 līdz 12 mesh (1,6 – 2,5 mm graudiņi, kristālisks alumosilikāts, poru diametrs 0,3 mm)
3.5. Alumīnija oksīds: I aktivitātes klases skābais alumīnija oksīds kolonnas hromatogrāfijai
100 g alumīnija oksīda liek piemērotā traukā un pievieno 2,0 ml ūdens. Aiztaisa un krata apmēram 20 minūtes. Glabā cieši noslēgtā traukā.
3.6. Kālija dihidrogēnfosfāta šķīdums, c = 0,025 mol/l
Izšķīdina 3,40 g kālija dihidrogēnfosfāta AEŠH kvalitātes ūdenī 1000 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei un sajauc.
3.7. Nātrija hidrogēnfosfāta šķīdums, c = 0,025 mol/l
Izšķīdina 3,55 g bezūdens (vai 4,45 g dihidrāta, vai 8,95 g dodekahidrāta) nātrija hidrogēnfosfāta AEŠH kvalitātes ūdenī 1000 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei un sajauc.
3.8. AEŠH kustīgā fāze – sajauc kopā šādus reaģentus:
650 ml acetonitrila (3.3.),
250 ml AEŠH kvalitātes ūdens,
50 ml kālija dihidrogēnfosfāta šķīduma (3.6.),
50 ml nātrija hidrogēnfosfāta šķīduma (3.7.).
Izfiltrē caur 0,22 µm filtru (4.6.) un degazē šķīdumu (piemēram, 10 minūtes apstrādājot ar ultraskaņu).
3.9. Standartviela – tīrs robenidīns: 1,3–bis[(4–hlorbenzilidēn)amino] guanidīna hidrogēnhlorīds, E 750;
3.9.1. Robenidīna izejas standartšķīdums: 300 µg/ml:
Ar precizitāti līdz 0,1 mg nosver 30 mg robenidīna standartvielas (3.9.). Izšķīdina paskābinātā metanolā (3.2.) 100 ml mērkolbā, ar to pašu šķīdinātāju uzpilda līdz zīmei un sajauc. Ietin kolbu alumīnija folijā un glabā tumšā vietā.
3.9.2. Robenidīna standartšķīdums: 12 µg/ml;
10,0 ml izejas standartšķīduma (3.9.1.) iepilda 250 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar kustīgo fāzi (3.8.) un sajauc. Ietin kolbu alumīnija folijā un glabā tumšā vietā.
3.9.3. Kalibrēšanas šķīdumi.
50 ml kalibrētās kolbās iepilda attiecīgi 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 un 25,0 ml standartšķīduma (3.9.2.). Uzpilda līdz zīmei ar kustīgo fāzi (3.8.) un sajauc. Šie šķīdumi atbilst attiecīgi 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 un 6,0 µg/ml robenidīna. Šie šķīdumi jāsagatavo tieši pirms lietošanas.
4. Iekārtas
4.1. Stikla kolonna
Izgatavota no tumša stikla, aprīkota ar krānu un rezervuāru, kura tilpums ir apmēram 150 ml, iekšējais diametrs no 10 līdz 15 mm, garums 250 mm.
4.2. Laboratorijas kratītājs
4.3. Rotācijas ietvaicētājs
4.4. AEŠH iekārta, kurai ir ultravioletais detektors ar maināmu viļņu garumu vai diodu matricas detektors, kas darbojas 250 līdz 400 nm diapazonā. Šķidrumu hromatogrāfa kolonna: 300 mm x 4 mm, C18, 10 µm pildījuma daļiņas vai līdzvērtīga.
4.5. Stiklšķiedras filtrpapīrs (Whatman GF/A vai līdzvērtīgs)
4.6. Membrānas filtri, 0,22 µm
4.7. Membrānas filtri, 0,45 µm
5. Procedūra
Piezīme: robenidīns ir gaismasjutīgs. Visās operācijās jālieto tumša stikla trauki.
5.1. Vispārīgi noteikumi:
5.1.1. Lai pārbaudītu robenidīna un traucējošu vielu neesamību, jāveic kontrolbarības analīze;
5.1.2. Atgūstamības tests jāveic, analizējot kontrolbarību (5.1.1.), kurai ir pievienots tāds daudzums robenidīna, kas ir līdzīgs paraugā esošajam. Lai pievienotu piedevu 60 mg/kg: 3,0 ml izejas standartšķīduma (3.9.1.) pārnes koniskā 250 ml kolbā. Ietvaicē šķīdumu līdz aptuveni 0,5 ml slāpekļa plūsmā. Pievieno 15 g kontrolbarības, sajauc un atstāj uz 10 minūtēm, pirms sāk ekstrakciju (5.2.);
Piezīme: lietojot šo metodi, par kontrolbarību vajadzētu izmantot tāda paša tipa barību, kāda ir paraugā, un analīzēs nevajadzētu tikt konstatētam robenidīnam.
5.2. Ekstrakcija
Ar precizitāti līdz 0,01 g nosver apmēram 15 g sagatavotā parauga. Pārnes koniskā 250 ml kolbā un pievieno 100,0 ml paskābināta metanola (3.2.), aiztaisa un krata vienu stundu kratītājā (4.2.). Izfiltrē šķīdumu caur stiklšķiedras filtrpapīru (4.5.) un visu filtrātu savāc koniskā 150 ml kolbā. Pievieno 7,5 g molekulārā sieta (3.4.), aiztaisa un krata piecas minūtes. Nekavējoties izfiltrē caur stiklšķiedras filtrpapīru. Šo šķīdumu izmanto attīrīšanai (5.3.).
5.3. Attīrīšana:
5.3.1. Alumīnija oksīda kolonnas gatavošana;
Nelielu stikla vates tamponu ieliek stikla kolonnas (4.1.) apakšējā galā un sablīvē ar stikla spieķīti. Nosver 11,0 g sagatavotā alumīnija oksīda (3.5.) un ieliek kolonnā. Šajā stadijā būtu pēc iespējas jāsamazina gaisa iedarbība. Viegli uzsit pa uzpildīto kolonnu tās apakšējā galā, lai alumīnija oksīds sablīvējas.
5.3.2. Parauga attīrīšana;
Ar pipeti uz kolonnu pārnes 5,0 ml sagatavotā parauga ekstrakta (5.2.). Pieliek pipetes galu tuvu pie kolonnas sienas un ļauj šķīdumam absorbēties alumīnija oksīdā. Robenidīnu no kolonnas eluē ar 100 ml metanola (3.1.) ar plūsmas ātrumu no 2 līdz 3 ml/minūtē un savāc eluātu 250 ml apaļkolbā. Ar rotācijas ietvaicētāju (4.3.) ietvaicē metanola šķīdumu līdz sausam 40° C temperatūrā pazeminātā spiedienā. Sauso atlikumu no jauna izšķīdina 3 līdz 4 ml kustīgās fāzes (3.8.) un kvantitatīvi pārnes uz 10 ml mērkolbu. Kolbu izskalo ar vairākām 1 līdz 2 ml kustīgās fāzes porcijām un pārnes uz mērkolbu. Uzpilda līdz zīmei ar to pašu šķīdinātāju un sajauc. Alikvotu daļu izfiltrē caur 0,45 μm membrānas filtru (4.7.). Šo šķīdumu glabā AEŠH noteikšanai (5.4.).
5.4. Noteikšana ar AEŠH:
5.4.1. Parametri;
Ieteicams ievērot šādus nosacījumus:
5.4.1.1. Šķidruma hromatogrāfa kolonna (4.4.1.): AEŠH kustīgā fāze (3.8.), plūsmas ātrums – 1,5 līdz 2 ml/minūtē, detektora viļņu garums – 317 nm, iešļircinātais tilpums – 20 līdz 50 µl.
5.4.1.2. Pārbauda hromatogrāfijas sistēmas stabilitāti, vairākas reizes iešļircinot kalibrēšanas šķīdumu (3.9.3.), kas satur 3,6 mg/ml, līdz sasniedz nemainīgu smaiļu augstumu un aiztures laiku.
Citos apstākļos var strādāt, ja tie dod līdzvērtīgus rezultātus
5.4.2. Kalibrēšanas grafiks;
Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.9.3.) iešļircina vairākas reizes un izmēra katrai koncentrācijai atbilstošos pīķu augstumus (laukumus). Uzzīmē kalibrācijas grafiku, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu vidējos smaiļu augstumus vai laukumus, un uz abscisu ass – atbilstošās koncentrācijas µg/ml.
5.4.3. Parauga šķīdums.
Iešļircina parauga ekstraktu (5.3.2.) vairākas reizes, ņemot tādu pašu tilpumu kā kalibrēšanas šķīdumiem, un nosaka robenidīna smaiļu vidējo augstumu (laukumu).
6. Rezultātu aprēķināšana
6.1. Nosaka parauga šķīduma koncentrāciju µg/ml pēc robenidīna smaiļu vidējā augstuma (laukuma) parauga šķīdumā, salīdzinot ar kalibrēšanas grafiku (5.4.2.).
6.2. Robenidīna saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina pēc šādas formulas:
c x 200
w = –––––––,
m
kur:
c= robenidīna koncentrācija parauga šķīdumā µg/ml,
m = analizējamā parauga masa gramos.
7. Rezultātu izvērtējums
7.1. Identifikācija:
Nosakāmā komponenta identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskā noteikšanā vai, lietojot diodu matricas detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta spektru ar tā kalibrēšanas šķīduma (3.9.3.) spektru, kurš satur 6 µg/ml.
7.1.1. Paralēla hromatogrāfiskā noteikšana;
7.1.1.1. Parauga ekstraktam pievieno piedevu, pielejot attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.9.3.). Pievienotā robenidīna daudzumam vajadzētu būt līdzīgam aprēķinātajam parauga ekstraktā atrastajam robenidīna daudzumam.
7.1.1.2. Tikai robenidīna smailes augstumam būtu jāpalielinās, ņemot vērā pievienoto daudzumu un ekstrakta atšķaidījumu. Smailes platumam vietā, kas ir puse no tās maksimālā augstuma, jābūt apmēram 10% robežās no bezpiedevas smailes attiecīgā platuma.
7.1.2. Konstatēšana ar diodu matricas detektoru.
Rezultātus vērtē pēc šādiem kritērijiem:
a) parauga maksimālās absorbcijas un standartspektra viļņu garumiem, ko reģistrē smailes virsotnē hromatogrammā, jābūt vienādiem detektora sistēmas izšķirtspējas noteiktās robežās. Diodu matricas detektoram šīs robežas parasti ir apmēram 2 nm;
b) starp 250 un 400 nm, paraugs un standartspektri, kas reģistrēti hromatogrammas smailes virsotnē, nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kas ir no 10 līdz 100% relatīvās absorbcijas diapazonā. Atbilstība šim kritērijam ir panākta, ja maksimumi sakrīt un nevienā novērojamā punktā novirze starp abiem spektriem nepārsniedz 15% no nosakāmā standarta komponenta absorbcijas;
c) starp 250 un 400 nm, parauga ekstrakta smailes kāpuma virsotnes un krituma spektri cits no cita nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kas ir 10 līdz 100% relatīvās absorbcijas diapazonā. Atbilstība šim kritērijam ir panākta, ja maksimumi sakrīt un nevienā novērojamā punktā novirze starp spektriem nepārsniedz 15% no smailes virsotnes spektra absorbcijas.
Ja nav atbilstības kaut vienam no šiem kritērijiem, nosakāmā komponenta esamība nav apstiprināta.
7.2. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu vienam un tam pašam paraugam paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10% no lielākā rezultāta, kur robenidīna saturs pārsniedz 15 mg/kg.
7.3. Atgūstamība
Kontrolparaugam ar piedevu atgūstamībai vajadzētu būt vismaz 85%.
8. Salīdzinošās testēšanas rezultāti
Kopiena organizēja salīdzinošo testēšanu, kurā 12 laboratorijās analizēja četrus saberztas vai granulu formas mājputnu un trušu barības paraugus. Katru paraugu analizēja divas reizes.
Rezultāti ir apkopoti šajā tabulā:
|
Mājputnu barība |
Trušu barība |
|||
|
Saberzta |
Granulēta |
Saberzta |
Granulēta |
|
|
Vidēji (mg/kg) |
27,00 |
27,99 |
43,6 |
40,1 |
|
Sr (mg/kg) |
1,46 |
1,26 |
1,44 |
1,66 |
|
CVr (%) |
5,4 |
4,5 |
3,3 |
4,1 |
|
Sr (mg/kg) |
4,36 |
3,36 |
4,61 |
3,91 |
|
CVR (%) |
16,1 |
12,0 |
10,6 |
9,7 |
|
Atgūstamība (%) |
90,0 |
93,3 |
87,2 |
80,2 |
|
Sr = atkārtojamības standartnovirze |
||||
|
CVr = atkārtojamības variāciju koeficients |
||||
|
SR = reproducējamības standartnovirze |
||||
|
CVR = reproducējamības variāciju koeficients |
||||
Zemkopības ministrs M.Roze
38.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Metilbenzokvāta noteikšana
7-benziloksi-6-butil-3-metoksikarbonil-4-hinolona
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka metilbenzokvātu barībā. Zemākā noteikšanas robeža ir 1 mg/kg.
2. Princips
Metilbenzokvātu no parauga ekstrahē ar metānsulfonskābes šķīdumu metilspirtā. Ekstraktu attīra ar dihlormetānu jonu apmaiņas hromatogrāfijā un pēc tam vēlreiz ar dihlormetānu. Metilbenzokvāta saturu nosaka ar apgrieztās fāzes augstas efektivitātes šķidruma hromatogrāfiju (AEŠH) ar UV detektoru.
3. Reaģenti
3.1. Dihlormetāns
3.2. AEŠH kvalitātes metanols
3.3. AEŠH kustīgā fāze: metanola (3.2.) un AEŠH kvalitātes ūdens maisījums 75 +25 (v + v)
Izfiltrē caur 0,22 µm filtru (4.5.) un degazē šķīdumu (piemēram, 10 minūtes apstrādājot ar ultraskaņu).
3.4. Metānsulfonskābes šķīdums – s = 2%
Atšķaida 20,0 ml metānsulfonskābes līdz 1000 ml ar metanolu (3.2.).
3.5. Sālsskābes šķīdums – s = 10 %
Atšķaida 100 ml sālsskābes (1,18 g/ml) līdz 1000 ml ar ūdeni.
3.6. Katjonu apmaiņas sveķi Amberlite CG–120 (Na), 100 līdz 200 mesh
Pirms lietošanas sveķus apstrādā: 100g sveķu samaisa ar 500 ml sālsskābes šķīduma (3.5.) un, nepārtraukti maisot, karsē uz elektriskās plītiņas, līdz sāk vārīties. Ļauj atdzist un nodekantē skābi. Ar vakuumu izfiltrē caur filtrpapīru. Sveķus divas reizes mazgā ar 500 ml ūdens un pēc tam ar 250 ml metanola (3.2.). Sveķus skalo vēl ar 250 ml metanola un žāvē uz filtra, sūknējot cauri gaisu. Izžāvētos sveķus glabā noslēgtā pudelē.
3.7. Standartviela: tīrs metilbenzokvāts (7–benziloksi–6–butil–3–metoksikarbonil–4–hinolons):
3.7.1. Metilbenzokvāta izejas standartšķīdums, 500 µg/ml;
Nosver 50 mg standartvielas (3.7.) ar precizitāti līdz 0,1 mg, izšķīdina metānsulfonskābes šķīdumā (3.4.) 100 ml mērkolbā, uzpilda līdz atzīmei un sajauc.
3.7.2. Metilbenzokvāta standartšķīdums, 50 µg/ml;
5,0 ml izejas standartšķīduma (3.7.1.) pārnes uz 50 ml mērkolbu, uzpilda līdz atzīmei ar metanolu (3.2.) un sajauc.
3.7.3. Kalibrēšanas šķīdumi;
Pārnes 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, un 5,0 ml metilbenzokvāta standartšķīduma (3.7.2.) uz 25 ml mērkolbām. Uzpilda līdz atzīmei ar kustīgo fāzi (3.3.) un sajauc. Šajos šķīdumos metilbenzokvāta koncentrācija ir attiecīgi 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, un 10,0 µg/ml. Šie šķīdumi jāsagatavo tieši pirms lietošanas.
4. Iekārtas
4.1. Laboratorijas kratītājs
4.2. Rotācijas ietvaicētājs
4.3. Stikla kolonna (250 mm x 15 mm), kas aprīkota ar krānu un rezervuāru, kura tilpums ir apmēram 200 ml
4.4. AEŠH iekārta, kurai ir ultravioletais detektors ar maināmu viļņu garumu vai diodu matricas detektors
4.4.1. Šķidrumu hromatogrāfa kolonna: 300 mm x 4 mm, C18, 10 µm pildījuma daļiņas vai līdzvērtīga
4.5. Membrānas filtri – 0,22 µm
4.5. Membrānas filtri – 0,45 µm
5. Procedūra
5.1. Vispārīgi noteikumi:
5.1.1. Lai pārbaudītu metilbenzokvāta un traucējošu vielu neesamību, jāveic kontrolbarības analīze;
5.1.2. Jāveic atgūstamības tests, analizējot kontrolbarību, kurai ir pievienota metilbenzokvāta piedeva tādā daudzumā, kas ir līdzīgs paraugā esošajam. Lai pievienotu piedevu 15 mg/kg, 20 gramiem kontrolbarības pielej 600 µl izejas standartšķīduma (3.7.1.), sajauc un atstāj uz 10 minūtēm, pirms sāk ekstrakciju (5.2.);
Piezīme: lietojot šo metodi, par kontrolbarību vajadzētu izmantot tāda paša tipa barību, kāda ir paraugā, un analīzēs nevajadzētu tikt konstatētam metilbenzokvātam.
5.2. Ekstrakcija
Nosver apmēram 20 g sagatavotā parauga ar precizitāti līdz 0,01 g un pārnes uz konisku 250 ml kolbu. Pievieno 100,0 ml metānsulfonskābes šķīduma (3.4.) un mehāniski krata (4.1.) 30 minūtes. Izfiltrē šķīdumu caur filtrpapīru, un filtrātu izmanto šķidruma–šķidruma ekstrakcijā (5.3.).
5.3. Šķidruma–šķidruma ekstrakcija
500 ml dalāmajā piltuvē, kurā ir 100 ml sālsskābes šķīduma (3.5.), pārnes 25,0 ml iegūtā filtrāta (5.2.). Pievieno 100 ml dihlormetāna (3.1.) un krata vienu minūti. Ļauj slāņiem atdalīties un nolaiž apakšējo (dihlormetāna) slāni 500 ml apaļkolbā. Ūdens fāzes ekstrakciju atkārto ar vēl divām 40 ml dihlormetāna devām un apvieno tās ar pirmo ekstraktu apaļkolbā. Ar rotācijas ietvaicētāju (4.2.) pazeminātā spiedienā 40 °C temperatūrā ietvaicē dihlormetāna ekstraktu līdz sausam. Izšķīdina sauso atlikumu 20 līdz 25 ml metanola (3.2.), aiztaisa kolbu un visu ekstraktu glabā jonu apmaiņas hromatogrāfijai (5.4.).
5.4. Jonu apmaiņas hromatogrāfija:
5.4.1. Katjonu apmaiņas kolonnas sagatavošana;
Stikla kolonnas (4.3.) apakšējā galā ieliek stikla vates tamponu. Samaisa 5,0 g apstrādāto katjonu apmaiņas sveķu (3.6.) un 50 ml sālsskābes (3.5.), ielej stikla kolonnā un ļauj nostāties. Nolej lieko skābi tā, lai skābes līmenis ir tikai nedaudz virs sveķu virsmas, un mazgā kolonnu ar ūdeni, līdz eluāts ir neitrāls pēc lakmusa. 50 ml metanola (3.2.) pārnes uz kolonnu un ļauj notecēt līdz sveķu virsmai.
5.4.2. Kolonnas hromatogrāfija.
Ar pipeti uzmanīgi pārnes iegūto ekstraktu (5.3.) uz kolonnu. Izskalo apaļkolbu ar divām 5 līdz 10 ml devām metanola (3.2.) un saskalojumus pārnes uz kolonnu. Nodrošinot, ka plūsmas ātrums nepārsniedz 5 ml minūtē, ekstraktu nolaiž līdz sveķu virsmai, un kolonnu izmazgā ar 50 ml metanola. Eluātu izmet. Ar 150 ml metānsulfonskābes šķīduma (3.4.) no kolonnas eluē metilbenzokvātu, un kolonnas eluātu savāc koniskā 250 ml kolbā.
5.5. Šķidruma–šķidruma ekstrakcija
5.5.1. Iegūto eluātu (iegūts punktā 5.4.2.) pārnes 1 litra dalāmajā piltuvē. Izskalo konisko kolbu ar 5 līdz 10 ml metanola (3.2.), un saskalojumus apvieno ar dalāmās piltuves saturu. Pievieno 300 ml sālsskābes šķīduma (3.5.) un 130 ml dihlormetāna (3.1.). Krata 1 minūti un ļauj fāzēm atdalīties. Nolaiž apakšējo (dihlormetāna) slāni 500 ml apaļkolbā. Ūdens fāzes ekstrakciju atkārto ar vēl divām 70 ml dihlormetāna devām, un šos ekstraktus apvieno ar pirmo ekstraktu apaļkolbā.
5.5.2. Ar rotācijas ietvaicētāju (4.2.) pazeminātā spiedienā 40 °C temperatūrā ietvaicē dihlormetāna ekstraktu līdz sausam. Kolbā sauso atlikumu izšķīdina ar apmēram 5 ml metanola (3.2.) un šo šķīdumu kvantitatīvi pārnes uz 10 ml mērkolbu. Izskalo apaļkolbu ar vēl divām 1 līdz 2 ml devām metanola, un saskalojumus pārnes mērkolbā. Uzpilda līdz zīmei ar metanolu un sajauc. Alikvotu daļu izfiltrē caur membrānas filtru (4.6.). Šo šķīdumu glabā AEŠH noteikšanai (5.6.).
5.6. AEŠH noteikšana:
5.6.1. Parametri:
Ieteicams ievērot šādus nosacījumus:
– šķidruma hromatogrāfa kolonna (4.4.1.),
– AEŠH kustīgā fāze: metanola un ūdens maisījums (3.3.),
– plūsmas ātrums: 1 līdz 1,5 ml/minūtē,
– noteikšanas viļņu garums: 265 nm,
– ievadāmais tilpums: 20 līdz 50 µl.
Pārbauda hromatogrāfijas sistēmas stabilitāti, vairākas reizes ievadot kalibrēšanas šķīdumu (3.7.3.), kas satur 4 µg/ml, līdz sasniedz nemainīgu smaiļu augstumu vai laukumu un aiztures laiku.
Var strādāt citos apstākļos, ja tie dod līdzvērtīgus rezultātus.
5.6.2. Kalibrēšanas grafiks;
Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.7.3.) ievada vairākas reizes, un izmēra katrai koncentrācijai atbilstošos smaiļu augstumus (laukumus). Uzzīmē kalibrācijas līkni, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu vidējos smaiļu augstumus vai laukumus un uz abscisu – ass atbilstošās koncentrācijas µg/ml.
5.6.3. Parauga šķīdums.
Iešļircina parauga ekstraktu (5.5.) vairākas reizes, ņemot tādu pašu tilpumu kā kalibrēšanas šķīdumiem, un nosaka metilbenzokvāta smaiļu vidējo augstumu (laukumu).
6. Rezultātu aprēķināšana
6.1. Nosaka parauga šķīduma koncentrāciju µg/ml pēc parauga šķīduma metilbenzokvāta smaiļu vidējā augstuma (rajona), salīdzinot ar kalibrēšanas grafiku (5.6.2.).
6.2. Metilbenzokvāta saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina pēc šādas formulas:
c x 40
w = ––––––,
m
kur:
c= metilbenzokvāta koncentrācija parauga šķīdumā µg/ml,
m = testa porcijas masa gramos.
7. Rezultātu izvērtējums
7.1. Identifikācija:
Nosakāmā komponenta identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskā noteikšanā vai lietojot diodu matricas detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta spektru ar tā kalibrēšanas šķīduma (3.7.3.) spektru, kurš satur 10 µg/ml.
7.1.1. Paralēla hromatogrāfiskā noteikšana;
Parauga ekstraktam pievieno piedevu, pielejot attiecīgu daudzumu standartšķīduma (3.7.2.). Pievienotā metilbenzokvāta daudzumam vajadzētu būt līdzīgam parauga ekstraktā aprēķinātajam metilbenzokvāta daudzumam. Tikai metilbenzokvāta pīķa augstumam būtu jāpalielinās, ņemot vērā pievienoto daudzumu un ekstrakta atšķaidījumu. Pīķa platumam vietā, kas ir puse no tā maksimālā augstuma, jābūt apmēram 10% robežās no bezpiedevas smailes attiecīgā platuma.
7.1.2. Konstatēšana ar diodu matricas detektoru.
Rezultātus vērtē pēc šādiem kritērijiem:
a) parauga maksimālās absorbcijas un standartspektru viļņu garumiem, ko reģistrē smailes virsotnē hromatogrammā, jābūt vienādiem detektora sistēmas izšķirtspējas noteiktās robežās. Diodu matricas detektoram šīs robežas parasti ir apmēram 2 nm;
b) starp 220 un 350 nm, paraugs un standartspektri hromatogrammā reģistrētajā smailes virsotnē nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kas ir 10 līdz 100% relatīvās absorbcijas diapazonā. Atbilstība šim kritērijam ir panākta, ja maksimumi sakrīt un nevienā novērojamā punktā novirze starp abiem spektriem nepārsniedz 15% no nosakāmā standarta komponenta absorbcijas;
c) starp 220 un 350 nm parauga ekstrakta smailes kāpuma virsotnes un krituma spektri cits no cita nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kas ir no 10 līdz 100% relatīvās absorbcijas diapazonā. Atbilstība šim kritērijam ir panākta, ja maksimumi sakrīt un nevienā novērojamā punktā novirze starp spektriem nepārsniedz 15% no smailes virsotnes spektra absorbcijas.
Ja nav atbilstības kaut vienam no šiem kritērijiem, nosakāmā komponenta esamība nav apstiprināta.
7.2. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu vienam un tam pašam paraugam paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10% no lielākā rezultāta, kur metilbenzokvāta saturs ir starp 4 un 20 mg/kg.
7.3. Atgūstamība
Kontrolparaugam ar piedevu atgūstamībai vajadzētu būt vismaz 90 %.
8. Salīdzinošās testēšanas rezultāti
10 laboratorijās analizēja piecus paraugus. Katru paraugu analizēja divas reizes.
Rezultāti
|
Kontrolparaugs |
1. saberztās barības paraugs |
1.granulētās barības paraugs |
2. saberztās barības paraugs |
2. granulētās barības paraugs |
|
|
vidēji mg/kg Sr (mg/kg) CVr (%) Sr (mg/kg) CVR (%) Atgūstamība (%) |
n.a. – – – – – |
4,50 0,30 6,70 0,40 8,90 92,00 |
4,50 0,20 4,40 0,50 11,10 93,00 |
8,90 0,60 6,70 0,90 10,10 92,00 |
8,70 0,50 5,70 1,00 11,50 89,00 |
|
n.a. = nav atklāts Sr = atkārtojamības standartnovirze CVr = atkārtojamības variāciju koeficients SR = reproducējamības standartnovirze CVR = reproducējamības variāciju koeficients |
|||||
Zemkopības ministrs M.Roze
39.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Amprolija noteikšana
1–[(4–amino–2–propilpirimidin–5–il)–metil]–2–metilpiridīna hlorīda hidrogēnhlorīds
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka amprolija saturu barībā un premiksos. Metodes kvalitatīvās noteikšanas robeža ir 1 mg/kg, kvantitatīvās noteikšanas robeža– 25 mg/kg.
2. Princips
Paraugu ekstrahē ar metanola un ūdens maisījumu. Pēc atšķaidīšanas ar kustīgo fāzi un membrānfiltrācijas amprolija saturu nosaka ar katjonu apmaiņas augstas efektivitātes šķidrumu hromatogrāfijas metodi (AEŠH), izmantojot UV detektoru.
3. Reaģenti
3.1. Metanols
3.2. Acetonitrils– AEŠH kvalitātes ūdens
3.3. Ūdens AEŠH kvalitātes
3.4. Nātrija dihidrogēnfosfāta šķīdums– c = 0,1 mol/l
1000 ml tilpuma mērkolbā ūdenī (3.3.) izšķīdina 13,80 g nātrija dihidrogēnfosfāta monohidrāta, uzpilda līdz zīmei ar ūdeni (3.3.) un sajauc.
3.5. Nātrija perhlorāta šķīdums– c = 1,6 mol/l: 1000 ml tilpuma mērkolbā ūdenī (3.3.) izšķīdina 224,74 g nātrija perhlorāta monohidrāta, uzpilda līdz zīmei ar ūdeni (3.3) un sajauc
3.6. AEŠH kustīgā fāze (sk. 9.1. piezīmi)
Acetonitrila (3.2.), nātrija dihidrogēnfosfāta šķīduma (3.4.) un nātrija perhlorāta šķīduma (3.5.) maisījums 450+450+100 (v+v+v). Pirms lietošanas filtrē caur 0,22 μm membrānfiltru (4.3) un šķīdumu degazē (piemēram, ultraskaņas vannā (4.4.) vismaz 15 minūtes).
3.7. Standartviela: tīrs amprolijs, 1–[(4–amino–2–propilpirimidin–5–il)–metil]–2–metil–piridīna hlorīda hidrogēnhlorīds, E 750 (sk. 9.2.):
3.7.1. Amprolija izejas standartšķīdums– 500 μg/ml;
Iesver 50 mg amprolija (3.7.) ar precizitāti līdz 0,1 mg 100 ml tilpuma mērkolbā, izšķīdina 80 ml metanola (3.1.) un kolbu uz 10 minūtēm ievieto ultraskaņas vannā (4.4.). Pēc iedarbības ar ultraskaņu, šķīdumu atdzesē līdz istabas temperatūrai, kolbu uzpilda līdz zīmei ar ūdeni un sajauc. Šķīdums 4°C temperatūrā ir stabils vienu mēnesi.
3.7.2. Amprolija darba standartšķīdums, 50 μg/ml.
Ar pipeti 5 ml izejas standartšķīduma (3.7.1.) pārnes 50 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar ekstrakcijas šķīdinātāju (3.8.) un sajauc. Šķīdums 4°C temperatūrā ir stabils vienu mēnesi.
3.7.3. Kalibrēšanas šķīdumi
Attiecīgi 0,5 ml, 1 ml un 2 ml darba standartšķīduma (3.7.2.) pārnes 50 ml tilpuma mērkolbās. Uzpilda līdz zīmei ar kustīgo fāzi (3.6.) un sajauc. Šādi pagatavoti šķīdumi atbilst attiecīgi 0,5, 1 un 2 µg amprolija uz ml. Šie šķīdumi jāsagatavo tieši pirms lietošanas.
3.8. Ekstrakcijas šķīdinātājs– metanola (3.1.) maisījums ar ūdeni 2+1 (v+v)
4. Aparatūra
4.1. Augstas efektivitātes šķidrumu hromatogrāfs ar ievadīšanas sistēmu, kas piemērota 100 μl tilpuma ievadīšanai:
4.1.1. Katjonu apmaiņas šķidruma hromatogrāfijas kolonna– 125 mm x 4 mm ar 10 μm Nucleosil 10 SA pildījumu vai tai līdzvērtīga;
4.1.2. UV detektors ar maināmu viļņa garumu vai diodu matricas detektors.
4.2. Membrānfiltrs– PTFE materiāla, 0,45 µm
4.3. Membrānfiltrs– 0,22 μm
4.4. Ultraskaņas vanna
4.5. Mehāniskais kratītājs vai magnētiskais maisītājs
5. Procedūra
5.1. Vispārīgi noteikumi:
5.1.1. Tukšā parauga analīze;
Atgūstamības pārbaudes (5.1.2.) veikšanai analizē barības tukšo paraugu, lai pārbaudītu, vai paraugā nav amprolija vai traucējošu vielu. Tukšajam paraugam būtu jābūt līdzīgam analizējamajam paraugam pēc veida, un tas nedrīkst saturēt amproliju vai traucējošas vielas.
5.1.2. Atgūstamības pārbaude.
5.1.2.1. Atgūstamības pārbaudi veic, izmantojot barības tukšo kontrolparaugu ar amprolija piedevu tādā daudzumā, kas ir līdzīgs analizējamajā paraugā esošajam amprolija daudzumam. Lai paraugam pievienotu piedevu 100 mg/kg, koniskā 250 ml tilpuma kolbā pārnes 10 ml izejas standartšķīduma (3.7.1.) un to ietvaicē līdz apmēram 0,5 ml. Pievieno 50 g barības tukšā parauga, rūpīgi sajauc un pirms ekstrakcijas posma (5.2.) atstāj uz 10 minūtēm, vairākas reizes sajaucot.
5.1.2.2. Ja nav pieejams analizējamajam paraugam līdzīgs tukšais paraugs (sk. 5.1.1.), atgūstamību nosaka pēc standartpiedevu metodes. Šādā gadījumā analizējamajam paraugam pievieno amprolija daudzumu, kas ir līdzīgs analizējamajā paraugā jau esošajam daudzumam. Šo paraugu analizē kopā ar paraugu bez standartpiedevas un atgūstamību aprēķina pēc starpības.
5.2. Ekstrakcija:
5.2.1. Premiksi (ar amprolija saturu < 1 %) un barība;
Atkarībā no amprolija satura nosver 5 līdz 40 g parauga ar precizitāti līdz 0,01 g, ko pārnes uz 500 ml tilpuma konisko kolbu, un pievieno 200 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.8.). Kolbu uz 15 minūtēm ievieto ultraskaņas vannā (4.4.). Kolbu izņem no ultraskaņas vannas un 1 stundu krata, izmantojot kratītāju, vai maisa ar magnētisko maisītāju (4.5.). Ekstrakta alikvotu atšķaida ar kustīgo fāzi (3.6.) līdz amprolija koncentrācijai 0,5–2 μg/ml un sajauc (sk. 9.3 piezīmi). Šā atšķaidītā šķīduma 5 līdz 10 ml filtrē ar membrānas filtru (4.2.). Veic katjonu apmaiņas augstas efektivitātes šķidrumu hromatogrāfiju (5.3.).
5.2.2. Premiksi (ar amprolija saturu 1 %).
Atkarībā no amprolija satura nosver 1 līdz 4 g premiksa ar precizitāti līdz 0,001 g, pārnes uz 500 ml tilpuma konisko kolbu un pievieno 200 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.8.). Kolbu uz 15 minūtēm ievieto ultraskaņas vannā (4.4.). Kolbu izņem no ultraskaņas vannas un 1 stundu krata, izmantojot kratītāju, vai maisa ar magnētisko maisītāju (4.5.). Ekstrakta alikvotu atšķaida ar kustīgo fāzi (3.6.) līdz amprolija koncentrācijai 0,5–2 μg/ml un sajauc. Šā atšķaidītā šķīduma 5 līdz 10 ml filtrē ar membrānas filtru (4.2.). Veic katjonu apmaiņas augstas efektivitātes šķidrumu hromatogrāfiju (5.3.).
5.3. Augstas efektivitātes šķidrumu hromatogrāfija:
5.3.1. Parametri;
Ieteicams ievērot šādus nosacījumus, citos apstākļos var strādāt, ja tie dod līdzvērtīgus rezultātus:
|
Šķidruma hromatogrāfijas kolonna (4.1.1.): Kustīgā fāze (3.6.): Plūsmas ātrums: Noteikšanas viļņu garums: Ievadītais tilpums: |
Katjonu apmaiņas šķidruma hromatogrāfijas kolonna, 125 mm x 4 mm, ar 10 μm Nucleosil 10 SA pildījumu vai līdzvērtīgu. Acetonitrila (3.2.), nātrija dihidrogēnfosfāta šķīduma (3.4.) un nātrija perhlorāta šķīduma (3.5.) maisījums 450+450+100 (v+v+v). 0,7 līdz 1 ml/min. 264 nm. 100 μl. |
Pārbauda hromatogrāfiskās sistēmas stabilitāti, vairākas reizes ievadot kalibrēšanas šķīdumu (3.7.3.), kas satur 1,0 μg/ml, līdz iegūst vienādus pīķu augstumus un vienādu aiztures laiku.
5.3.2. Kalibrēšanas grafiks;
Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.7.3.) ievada vairākas reizes un nosaka katrai koncentrācijai atbilstošo vidējo pīķa augstumu (vai laukumu). Konstruē kalibrēšanas līkni, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu pīķu vidējos augstumus (vai laukumus), un uz abscisu ass– attiecīgās koncentrācijas µg/ml.
5.3.3. Parauga šķīdums.
Vairākas reizes ievada parauga ekstraktu (5.2.), ņemot tādu pašu tilpumu kā kalibrēšanas šķīdumiem, un nosaka amprolija pīķu vidējo augstumu (laukumu).
6. Rezultātu aprēķināšana
6.1. Izmantojot kalibrēšanas līkni (5.3.2.), parauga ekstraktā pēc amprolija pīķa vidējā augstuma (vai laukuma) nosaka amprolija koncentrāciju parauga šķīdumā μg/ml.
6.2. Amprolija saturu (w) analizējamajā paraugā aprēķina pēc šādas formulas:
7. Rezultātu izvērtējums
7.1. Identifikācija:
Analīta identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskajā analīzē vai lietojot diodu matricas detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta (5.2.) spektru ar tā kalibrēšanas šķīduma (3.7.3.) spektru, kas satur 2,0 µg /ml amprolija.
7.1.1. Paralēla hromatogrāfiskā analīze;
7.1.1.1. Parauga ekstraktam (5.2.) pievieno attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.7.3.). Pievienotā amprolija daudzumam jābūt aptuveni vienādam ar parauga ekstraktā noteikto amprolija daudzumu.
7.1.1.2. Ņemot vērā pievienoto daudzumu un ekstrakta atšķaidījumu, būtu jāpalielinās tikai amprolija smailes augstumam. Smailes pusaugstuma platumam jābūt ± 10 % no bezpiedevas parauga ekstrakta amprolija smailes pusaugstuma platuma.
7.1.2. Noteikšana ar diodu matricas detektoru.
Rezultātus izvērtē pēc šādiem kritērijiem:
a) parauga maksimālās absorbcijas un standartspektra viļņa garumam, ko reģistrē smailes virsotnē hromatogrammā, detektora sistēmas izšķirtspējas robežās jābūt vienādam. Diodu matricas detektoram šīs robežas parasti ir ± 2 nm;
b) no 210 līdz 320 nm, paraugs un standartspektri, kas reģistrēti hromatogrammas smailes virsotnē, nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kas ir 10– 100 % relatīvās absorbcijas diapazonā. Šis kritērijs ir ievērots, ja maksimumi sakrīt un nevienā novērojamā punktā novirze starp abiem spektriem nepārsniedz 15% no nosakāmās vielas standarta absorbcijas.
c) no 210 līdz 320 nm parauga ekstrakta radītā smailes kāpuma, virsotnes un krituma spektri cits no cita nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kas ir 10 līdz 100 % relatīvās absorbcijas diapazonā. Šis kritērijs ir ievērots, ja maksimumi sakrīt un ja nevienā novērojamā punktā novirze starp spektriem nepārsniedz 15% no smailes virsotnes spektra absorbcijas.
Ja kāds no šiem kritērijiem nav ievērots, nosakāmās vielas klātbūtne nav apstiprinājusies.
7.2. Atkārtojamība
No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirības nedrīkst pārsniegt:
7.2.1. 15% no lielākās noteiktās vērtības, ja amprolija saturs ir no 25 mg/kg līdz 500 mg/kg
7.2.2. 75 mg/kg, ja amprolija saturs ir no 500 mg/kg līdz 1000 mg/kg
7.2.3. 7,5 % no lielākās noteiktās vērtības, ja amprolija saturs pārsniedz 1000 mg/kg
7.3. Atgūstamība
Kontrolparauga (tukšā parauga) ar piedevu atgūstamība ir vismaz 90 %.
8. Salīdzinošās testēšanas rezultāti
Tika sarīkota starplaboratoriju salīdzinošā testēšana, izmantojot trīs putnu barības paraugus (1. līdz 3. paraugs), vienu minerālbarības paraugu (4. paraugs) un vienu premiksa paraugs (5. paraugs). Salīdzinošās testēšanas rezultāti apkopoti tabulā:
|
1. paraugs (barības tukšais paraugs) |
2. paraugs |
3. paraugs |
4. paraugs |
5. paraugs |
|
|
L n vidējā vērtība [mg/kg] Sr [mg/kg] CVr [%] SR [mg/kg] CVR [%] |
14 56 – – – – – |
14 56 45,5 2,26 4,95 2,95 6,47 |
14 56 188 3,57 1,90 11,8 6,27 |
14 56 5 129 178 3,46 266 5,19 |
15 60 25 140 550 2,20 760 3,00 |
|
Nominālais saturs [mg/kg] |
– |
50 |
200 |
5 000 |
25 000 |
|
L laboratoriju skaits n atsevišķu vērtību skaits sr atkārtojamības standartnovirze CVr atkārtojamības variācijas koeficients SR reproducējamības standartnovirze CVR reproducējamības variācijas koeficients |
|||||
9. Piezīmes
9.1. Ja analizējamais paraugs satur tiamīnu, tiamīna pīķis hromatogrammā parādās īsi pirms amprolija pīķa. Analīzi veicot pēc šīs metodes, amprolijs un tiamīns ir jāatdala. Ja amproliju un tiamīnu neatdala kolonnā (4.1.1.), ko izmanto šajā metodē, kustīgajā fāzē (3.6.) līdz 50% acetonitrila aizstāj ar metanolu.
9.2. Saskaņā ar Britu Farmakopeju amprolija (0,02 mol/l) spektram sālsskābes šķīdumā (0,1 mol/l) maksimumi ir pie 246 nm un 262 nm. Absorbcija pie 246 nm ir 0,84, bet pie 262 nm attiecīgi 0,80.
9.3. Parauga ekstrakts noteikti jāatšķaida tikai ar kustīgo fāzi, citādi amprolija pīķa aiztures laiks var ievērojami mainīties jonu spēka izmaiņu dēļ.
Zemkopības ministrs M. Roze
40.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Diklazurila noteikšana
(+)-4-hlorfenil-[2,6-dihlor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-diokso-1,2,4-triazīn-2-il)fenil]acetonitrils
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka diklazurilu barībā un premiksos. Metodes kvalitatīvās noteikšanas robeža ir 0,1 mg/kg, kvantitatīvās noteikšanas robeža– 0,5 mg/kg.
2. Princips
Paraugu ekstrahē ar paskābinātu metanolu, pirms tam pievienojot iekšējo standartu. Barības ekstrakta alikvotu attīra, izmantojot C18 cietās fāzes ekstrakcijas kolonnu. Diklazurilu no kolonnas eluē ar paskābināta metanola un ūdens maisījumu. Pēc eluāta ietvaicēšanas, atlikumu izšķīdina DMFA/ūdenī. Premiksu ekstraktu ietvaicē, atlikumu izšķīdina DMFA/ūdenī. Diklazurila saturu nosaka trīskomponentu gradienta apgrieztās fāzes augstas efektivitātes šķidruma hromatogrāfijā (AEŠH), lietojot UV detektoru.
3. Reaģenti
3.1. AEŠH kvalitātes ūdens
3.2. Amonija acetāts
3.3. Tetrabutilamonija hidrogēnsulfāts (TBHS)
3.4. AEŠH kvalitātes acetonitrils
3.5. AEŠH kvalitātes metanols
3.6. N,N–dimetilformamīds (DMFA)
3.7. Sālsskābe, 20 = 1,19 g/ml
3.8. Standartviela: diklazurils II– (+)–4–hlorfenil–[2,6–dihlor–4–(2,3,4,5–tetrahidro–3,5–diokso–1,2,4–triazīn–2–il)fenil]acetonitrils ar garantētu tīrību, E771:
3.8.1. Diklazurila izejas standartšķīdums– 500 μg/ml;
Ar precizitāti līdz 0,1 mg 50 ml tilpuma mērkolbā iesver 25 mg diklazurila standartvielas (3.8.). Šķīdina DMFA (3.6.), uzpilda līdz zīmei ar DMFA (3.6.) un sajauc. Kolbu ietin alumīnija folijā vai izmanto kolbu no tumša stikla un glabā ledusskapī. Šķīdums 4°C temperatūrā ir stabils vienu mēnesi.
3.8.2. Diklazurila standartšķīdums– 50 μg/ml.
5,00 ml izejas standartšķīduma (3.8.1.) iepilda 50 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar DMFA (3.6.) un sajauc. Kolbu ietin alumīnija folijā vai izmanto kolbu no tumša stikla un glabā ledusskapī. Šķīdums 4°C temperatūrā ir stabils vienu mēnesi.
3.9. Iekšējais standarts: 2,6–dihlor––(4–hlorfenil)–4–(4,5–dihidro–3,5–diokso–1,2,4–triazin–2–(3H)il) –metilfenilacetonitrils:
3.9.1. Izejas iekšējā standarta šķīdums 500 μg/ml;
50 ml tilpuma mērkolbā iesver 25 mg iekšējā standarta vielas (3.9.) ar precizitāti līdz 0,1 mg. Šķīdina DMFA (3.6.), uzpilda līdz zīmei ar DMFA (3.6.), un sajauc. Kolbu ietin alumīnija folijā vai izmanto kolbu no tumša stikla, to glabā ledusskapī. Šķīdums 4°C temperatūrā ir stabils vienu mēnesi.
3.9.2. Iekšējā standarta šķīdums 50 μg/ml;
5,00 ml iekšējā standarta šķīduma (3.9.1.) pārnes 50 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar DMFA (3.6.) un sajauc. Kolbu ietin alumīnija folijā vai izmanto kolbu no tumša stikla, to glabā ledusskapī. Šķīdums 4°C temperatūrā ir stabils vienu mēnesi.
3.9.3. Iekšējā standarta šķīdums premiksu analīzēm– p/1000 mg/ml (p = diklazurila nominālais saturs premiksā, mg/kg).
Ar precizitāti līdz 0,1 mg iesver p/10 mg iekšējās standarta vielas 100 ml tilpuma mērkolbā, šķīdina DMFA (3.6) ultraskaņas vannā (4.6), uzpilda līdz zīmei ar DMFA un sajauc. Kolbu ietin alumīnija folijā vai izmanto kolbu no tumša stikla, to glabā ledusskapī. Šķīdums 4°C temperatūrā ir stabils vienu mēnesi.
3.10. Kalibrēšanas šķīdums, 2 μg/ml
Ar pipeti 50 ml tilpuma mērkolbā pārnes 2,00 ml diklazurila standarta šķīduma (3.8.2.) un 2,00 ml iekšējā standarta šķīduma (3.9.2.). Pievieno 16 ml DMFA (3.6.), uzpilda līdz zīmei ar ūdeni un sajauc. Šis šķīdums jāgatavo tieši pirms lietošanas.
3.11. C18 cietās fāzes ekstrakcijas kolonna, piemēram, Bond Elut, izmērs: 1 cm3, sorbenta masa: 100 mg
3.12. Ekstrakcijas šķīdinātājs: paskābināts metanols– ar pipeti 5,0 ml sālsskābes (3.7.) pievieno 1000 ml metanola (3.5.) un sajauc
3.13. AEŠH kustīgā fāze:
Eluents A: amonija acetāta un tetrabutilamonija hidrogēnsulfāta šķīdums.
3.13.1. Izšķīdina 5 g amonija acetāta (3.2.) un 3,4 g TBHS (3.3.) 1000 ml ūdens (3.1.) un sajauc;
3.13.2. Eluents B: acetonitrils (3.4.);
3.13.3. Eluents C: metanols (3.5.).
4. Aparatūra
4.1. Mehāniskais kratītājs
4.2. Iekārta trīskomponentu gradienta AEŠH:
4.2.1. Šķidruma hromatogrāfijas kolonna 100 mm x 4,6 mm, ar 3 μm Hypersil ODS vai līdzvērtīgu pildījumu;
4.2.2. UV detektors ar maināmu viļņa garumu vai diodu matricas detektors.
4.3. Rotācijas vakuumietvaicētājs
4.4. Membrānas filtrs 0,45 µm
4.5. Vakuumkolektors
4.6. Ultraskaņas vanna
5. Procedūra
5.1. Vispārīgi noteikumi:
5.1.1. Barības tukšais paraugs
Analizē tukšo paraugu, lai pārliecinātos, ka tajā nav ne diklazurila, ne noteikšanu traucējošu vielu. Tukšais paraugs pēc veida ir līdzīgs analizējamajam paraugam un, pārbaudot to, nebūtu jāatklājas diklazurilam vai noteikšanu traucējošām vielām.
5.1.2. Atgūstamības pārbaude
5.1.2.1. Atgūstamību pārbauda, izmantojot barības tukšo kontrolparaugu, kam pievieno tādu daudzumu diklazurila, kas ir līdzīgs paraugā esošajam daudzumam. Lai paraugam pievienotu piedevu līdz 1 mg/kg, 50 g barības tukšajam paraugam pievieno 0,1 ml izejas standartšķīduma (3.8.1.), rūpīgi sajauc un atstāj uz 10 minūtēm, pirms ekstrakcijas (5.2.) vairākas reizes rūpīgi maisot.
5.1.2.2. Ja nav analizējamajam paraugam līdzīga tukšā parauga (sk. 5.1.1.), atgūstamību nosaka pēc standarta piedevu metodes. Šādā gadījumā analizējamajam paraugam pievieno diklazurila daudzumu, kas ir līdzīgs analizējamajā paraugā jau esošajam daudzumam. Šo paraugu analizē kopā ar paraugu bez standartpiedevas un atgūstamību aprēķina pēc starpības.
5.2. Ekstrakcija:
5.2.1. Barība;
Nosver apmēram 50 g lielu paraugu ar precizitāti līdz 0,01 g. Pārnes to uz 500 ml tilpuma konisko kolbu, pievieno 1,00 ml iekšējā standarta šķīduma (3.9.2.), 200 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.12.), kolbu noslēdz ar aizbāzni. Maisījumu krata kratītājā (4.1.) visu nakti. Nostādina 10 minūtes. Pārnes dzidrā šķīduma 20 ml alikvotu piemērotā stikla traukā un atšķaida ar 20 ml ūdens. Šo šķīdumu pārnes uz ekstrakcijas kolonnu (3.11.) un izlaiž cauri, izmantojot vakuumu (4.5.). Kolonnu skalo ar 25 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.12.) un ūdens maisījumu tilpuma attiecībās 65+35 (v+v). Savāktās frakcijas izlej, un savienojumus eluē ar 25 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.12.) un ūdens maisījumu tilpuma attiecībā 80+20 (v+v). Šo frakciju ietvaicē ar rotācijas ietvaicētāja (4.3.) palīdzību 60°C temperatūrā, līdz kļūst sausa. Atlikumu šķīdina 1,0 ml DMFA (3.6.), pievieno 1,5 ml ūdens (3.1.) un sajauc. Filtrē caur membrānas filtru (4.4.). Veic augstas efektivitātes šķidruma hromatogrāfiju (5.3.).
5.2.2. Premiksi.
Nosver apmēram 1 g lielu paraugu ar precizitāti līdz 0,001 g. To pārnes uz 500 ml tilpuma konisko kolbu, pievieno 1,00 ml iekšējā standarta šķīduma (3.9.3.), 200 ml ekstrakcijas šķīdinātāja (3.12.) un kolbu noslēdz ar aizbāzni. Maisījumu visu nakti krata kratītājā (4.1.). Nostādina 10 minūtes. Dzidrā šķīduma alikvotu 10 000/p ml (p = diklazurila nominālais saturs premiksā, mg/kg) pārnes piemērota izmēra apaļkolbā. Ietvaicē to sausu, izmantojot rotācijas ietvaicētāju (4.3.), 60°C temperatūrā, līdz tikko kļūst sauss. Atlikumu šķīdina 10,0 ml DMFA (3.6.), pievieno 15,0 ml ūdens (3.1.) un sajauc. Veic augstas efektivitātes šķidrumu hromatogrāfiju (5.3.).
5.3. AEŠH noteikšana:
5.3.1. Kritēriji;
Ieteicams ievērot šādus nosacījumus:
|
Šķidruma hromatogrāfijas kolonna (4.2.1): |
100 mm x 4,6 mm, ar 3 μm Hypersil ODS, vai tam līdzvērtīgu pildījumu. |
|
|
– Kustīgā fāze: |
Eluents A (3.13.1): Eluents B (3.13.2): Eluents B (3.13.3): |
Amonija acetāta un tetrabutilamonija hidrogēnsulfāta ūdens šķīdums acetonitrils metanols |
|
– Eluēšanas režīms: Plūsmas ātrums: – Ievadītais tilpums: Detektora viļņu garums: |
– lineārs gradients – sākumā: A +B + C = 60 + 20 + 20 (v+v+v) – pēc 10 minūtēm gradienta eluēšanas 30 minūtes: A + B + C = 45 + 20 + 35 (v + v + v) Skalo ar B 10 minūtes 1,5– 2 ml/min 20 μl 280 nm |
|
Var strādāt citos apstākļos, ja tajos iegūst līdzvērtīgus rezultātus. Pārbauda hromatogrāfiskās sistēmas stabilitāti, vairākas reizes ievadot kalibrēšanas šķīdumu (3.10.), kas satur 2 μg/ml, līdz iegūst vienāda augstuma smailes un vienādu aiztures laiku.
5.3.2. Kalibrēšanas šķīdums;
Vairākas reizes ievada pa 20 μl kalibrēšanas šķīduma (3.10.) un nosaka diklazurila un iekšējā standarta smaiļu vidējo augstumu (laukumu).
5.3.3. Parauga šķīdums.
Vairākas reizes ievada pa 20 μl parauga šķīduma (5.2.1. vai 5.2.2.) un nosaka diklazurila un iekšējā standarta smaiļu vidējo augstumu (laukumu).
6. Rezultātu aprēķināšana
6.1. Barība
Diklazurila saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina pēc formulas:
7. Rezultātu izvērtējums
7.1. Identifikācija:
Nosakāmās vielas identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskajā analīzē vai lietojot diodu matricas detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta (5.2.1. vai 5.2.2.) spektru ar kalibrēšanas šķīduma (3.10.) spektru.
7.1.1. Paralēla hromatogrāfiskā analīze;
7.1.1.1. Parauga ekstraktam (5.2.1. vai 5.2.2.) pievieno attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.10.). Pievienotā diklazurila daudzumam jābūt aptuveni vienādam ar parauga ekstraktā noteikto diklazurila daudzumu.
7.1.1.2. Ņemot vērā pievienoto daudzumu un ekstrakta atšķaidījumu, būtu jāpalielinās tikai diklazurila un iekšējā standarta smailes augstumam. Smailes pusaugstuma platumam jābūt ± 10 % no sākotnējā parauga ekstrakta diklazurila vai iekšējā standarta smailes pusaugstuma platuma.
7.1.2. Noteikšana ar diodu matricas detektoru.
Rezultātus vērtē pēc šādiem kritērijiem:
a) parauga maksimālās absorbcijas un standartspektra viļņa garumam, ko reģistrē smailes virsotnē hromatogrammā, detektēšanas sistēmas izšķirtspējas noteiktās robežās jābūt vienādam. Diodu matricas detektoram šīs robežas parasti ir ± 2 nm;
b) starp 230 un 320 nm parauga un standarta spektri, kas reģistrēti hromatogrammas smailes virsotnē, nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kas ir 10 līdz 100 % relatīvās absorbcijas diapazonā. Atbilstība šim kritērijam ir panākta, ja maksimumi sakrīt un nevienā novērojamā punktā novirze starp abiem spektriem nepārsniedz 15% no nosakāmās vielas standarta absorbcijas;
c) no 230 līdz 320 nm parauga ekstrakta smailes kāpuma, virsotnes un krituma spektri cits no cita nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kas ir no 10 līdz 100 % relatīvās absorbcijas diapazonā. Atbilstība šim kritērijam ir panākta, ja maksimumi sakrīt un ja nevienā novērojamā punktā novirze starp spektriem nepārsniedz 15% no smailes virsotnes spektra absorbcijas.
Ja nav atbilstības kādam no šiem kritērijiem, nosakāmās vielas klātbūtne nav apstiprinājusies.
7.2. Atkārtojamība
No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirība nedrīkst pārsniegt:
7.2.1. 30 % no lielākās noteiktās vērtības, ja diklazurila saturs ir no 0,5 mg/kg līdz 2,5 mg/kg
7.2.2. 0,75 mg/kg, ja diklazurila saturs barībā ir no 2,5 mg/kg līdz 5 mg/kg
7.2.3. 15 % no lielākās noteiktās vērtības, ja diklazurila saturs pārsniedz 5 mg/kg
7.3. Atgūstamība
Tukšā parauga ar standartpiedevu atgūstamībai vajadzētu būt vismaz 80 %.
8. Salīdzinošās testēšanas rezultāti
Tika organizēta starplaboratoriju salīdzinošā testēšana, kurā 11 laboratorijās analizēja 5 paraugus. Divi analizējamie paraugi bija premiksi, viens ar organisku matricu (O 100), otrs ar neorganisku matricu (A 100). Abu paraugu teorētiskais diklazurila saturs ir 100 mg/kg. Trīs mājputniem domātas kombinētās barības paraugus ir ražojuši atšķirīgi ražotāji (NL) (L1/Z1/K1). Tajos teorētiskais diklazurila saturs ir 1 mg/kg. Laboratorijām tika dots norādījums visus paraugus analizēt vienu vai divas reizes. (Sīkāku informāciju par šīs starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas rezultātiem sk. Journal of AOAC International, Volume 77, No 6, 1994, p.1359–1361). Rezultāti apkopoti tabulā:
|
1. paraugs A 100 |
2. paraugs O 100 |
3. paraugs L 1 |
4. paraugs Z 1 |
5. paraugs K 1 |
|
|
L n vidējā vērtība sr [mg/kg] CVr [%] sR [mg/kg] CVR [%] |
11 19 100,8 5,88 5,83 7,59 7,53 |
11 18 103,5 7,64 7,38 7,64 7,38 |
11 19 0,89 0,15 17,32 0,17 18,61 |
11 19 1,15 0,02 1,92 0,11 9,67 |
6 12 0,89 0,03 3,34 0,12 13,65 |
|
Nominālais saturs [mg/kg] |
100 |
100 |
1 |
1 |
1 |
|
L laboratoriju skaits n atsevišķu vērtību skaits sr atkārtojamības standartnovirze CVr atkārtojamības variācijas koeficients sR reproducējamības standartnovirze CVR reproducējamības variācijas koeficients |
|||||
9. Piezīmes
Vispirms jāparāda, ka diklazurila signāla izmaiņas mērāmo koncentrāciju diapazonā ir lineāras.
Zemkopības ministrs M.Roze
41.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Karbadoksa noteikšana
Metil-3-(2-hinoksalinilmetilēn)karbazāta N1,N4-dioksīds
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka karbadoksa saturu dzīvnieku barībā, premiksos un preparātos. Metodes kvalitatīvās noteikšanas robeža ir 1 mg/kg, bet kvantitatīvās noteikšanas robeža– 10 mg/kg.
2. Princips
Paraugu līdzsvaro ar ūdeni un ekstrahē ar metanola un acetonitrila maisījumu. Analizējot barību, filtrēta ekstrakta alikvotu attīra alumīnija oksīda kolonnā. Analizējot premiksus un preparātus, filtrēta ekstrakta alikvotu līdz vajadzīgajai koncentrācijai atšķaida ar ūdeni, metanolu un acetonitrilu. Karbadoksa saturu nosaka apgrieztās fāzes augstas efektivitātes šķidruma hromatogrāfijā (AEŠH), lietojot UV detektoru.
3. Reaģenti
3.1. Metanols
3.2. Acetonitrils ar AEŠH tīrības pakāpi
3.3. Etiķskābe, w= 100%
3.4. Alumīnija oksīds: neitrāls– I aktivitātes klase
3.5. Metanola un acetonitrila maisījums 1 + 1 (v + v)
Sajauc 500 ml metanola (3.1.) ar 500 ml acetonitrila (3.2.)
3.6. Etiķskābe– = 10 %
Atšķaida 10 ml etiķskābes (3.3.) līdz 100ml tilpumam ar ūdeni
3.7. Nātrija acetāts (CH3COONa)
3.8. AEŠH kvalitātes ūdens
3.9. Acetāta buferšķīdums– c = 0,01 mol/l, pH = 6,0
Izšķīdina 0,82 g nātrija acetāta (3.7.) 700 ml ūdens (3.8.), un ar etiķskābi (3.6.) noregulē līdz pH 6,0. Pārnes 1000 ml tilpuma mērkolbā, uzpilda līdz atzīmei ar ūdeni (3.8.) un sajauc
3.10. Kustīgā fāze AEŠH
Sajauc 825 ml acetāta buferšķīduma (3.9.) ar 175 ml acetonitrila (3.2.). Šķīdumu filtrē caur 0,22 μm filtru (4.5.) un degazē (piemēram, 10 minūtes apstrādājot ar ultraskaņu).
3.11. Standartviela
Tīrs karbadokss: Metil–3–(2–hinoksalinilmetilēn)karbazāta N1,N4–dioksīds, E850:
3.11.1. Karbadoksa izejas standartšķīdums 100 μg/ml (sk. procedūras 5. punktā);
Ar precizitāti līdz 0,1 mg 250 ml tilpuma mērkolbā iesver 25 mg karbadoksa standartvielas (3.11.). Apstrādājot ar ultraskaņu (4.7.), izšķīdina metanola un acetonitrila maisījumā (3.5.). Pēc iedarbības ar ultraskaņu, šķīdumu atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz zīmei ar metanola un acetonitrila maisījumu (3.5.) un sajauc. Kolbu ietin alumīnija folijā vai izmanto kolbu no tumša stikla, to glabā ledusskapī. Šķīdums 4°C temperatūrā ir stabils vienu mēnesi.
3.11.2. Kalibrēšanas šķīdumi.
Attiecīgi 2,0 ml, 5,0 ml, 10,0 ml un 20,0 ml izejas standartšķīduma (3.11.1.) pārnes 100 ml tilpuma mērkolbās. Pievieno 30 ml ūdens, uzpilda līdz zīmei ar metanola un acetonitrila maisījumu (3.5.) un sajauc. Kolbu ietin alumīnija folijā. Šādi pagatavoto šķīdumu karbadoksa koncentrācija attiecīgi ir 2,0, 5,0, 10,0 un 20,0 μg/ml. Kalibrēšanas šķīdumi jāsagatavo tieši pirms lietošanas.
Piezīme: ja barībā karbadoksa saturs ir mazāks par 10 mg/kg, jāpagatavo kalibrēšanas šķīdumi ar koncentrāciju zem 2,0μg/ml.
3.12. Ūdens– [metanola– acetonitrila] (3.5.) maisījums (300+700 (v+v)) 300 ml ūdens sajauc ar 700 ml metanola un acetonitrila maisījuma (3.5.)
4. Aparatūra
4.1. Laboratorijas kratītājs vai magnētiskais maisītājs
4.2. Stiklašķiedras filtrpapīrs (Whatman GF/A vai līdzvērtīgs)
4.3. Stikla kolonna (garums 300 līdz 400 mm, iekšējais diametrs aptuveni 10 mm) ar poraina stikla starpsienu un noteces vārstu.
Piezīme: var izmantot arī stikla kolonnu ar aizspiedni vai sašaurinātu apakšdaļu; tādā gadījumā kolonnas apakšējā daļā ievieto nelielu stikla vates tamponu, ko sablīvē ar stikla spieķīti.
4.4. Augstas efektivitātes šķidrumu hromatogrāfs ar ievadīšanas sistēmu, kas piemērota 20 μl tilpuma ievadīšanai:
4.4.1. Šķidrumu hromatogrāfijas kolonna: 300 mm x 4 mm, C18, 10 μm pakojums vai līdzvērtīgs;
4.4.2. UV detektors ar maināmu viļņa garumu, vai diodu matricas detektors, kas darbojas viļņu garuma diapazonā no 225 līdz 400 nm.
4.5. Membrānas filtrs, 0,22 µm
4.6. Membrānas filtrs, 0,45 µm
4.7. Ultraskaņas vanna
5. Procedūra
Piezīme: karbadokss ir gaismasjutīgs. Visas procedūras veic samazinātā apgaismojumā, lieto tumša stikla traukus vai arī tos ietin alumīnija folijā.
5.1. Vispārīgi noteikumi:
5.1.1. Barības tukšais paraugs;
Atgūstamības pārbaudes (5.1.2.) veikšanai analizē tukšo paraugu, lai pārbaudītu, ka paraugā nav karbadoksa un traucējošu vielu. Tukšajam paraugam jābūt līdzīgam analizējamajam paraugam, tajā nedrīkst konstatēt karbadoksu vai noteikšanu traucējošas vielas.
5.1.2. Atgūstamības pārbaude.
5.1.2.1. Atgūstamības pārbaudi veic, analizējot barības tukšo paraugu (5.1.1.), kam pievieno tādu daudzumu karbadoksa, kas ir līdzīgs paraugā esošajam. Lai tukšajam paraugam pievienotu piedevu 50 mg/kg, ņem 5,0 ml izejas standartšķīduma (3.11.1.), ko pārnes 200 ml koniskā kolbā. Slāpekļa plūsmā šķīdumu ietvaicē līdz aptuveni 0,5 ml tilpumam. Pirms ekstrakcijas (5.2.) pievieno 10 g tukšā barības parauga, samaisa un atstāj uz 10 minūtēm.
5.1.2.2. Ja nav analizējamajam paraugam līdzīga tukšā parauga (sk. 5.1.1.), atgūstamību var noteikt pēc standarta piedevu metodes. Šādā gadījumā analizējamam paraugam pievieno karbadoksa daudzumu, kas ir līdzīgs analizējamajā paraugā jau esošajam daudzumam. Šo paraugu analizē kopā ar bezpiedevas paraugu, un atgūstamību aprēķina pēc starpības.
5.2. Ekstrakcija:
5.2.1. Barība;
Iesver apmēram 10 g parauga ar precizitāti līdz 0,01 g, ko pārnes uz 200 ml tilpuma konisko kolbu. Pievieno 15,0 ml ūdens, sajauc un atstāj uz 5 minūtēm. Pievieno 35,0 ml metanola un acetonitrila maisījuma (3.5.), kolbu noslēdz ar aizbāzni un uz 30 minūtēm ievieto kratītājā vai maisa ar magnētisko maisītāju (4.1.). Šķīdumu filtrē caur stiklašķiedras filtrpapīru (4.2.). Šo šķīdumu glabā attīrīšanai (5.3.).
5.2.2. Premiksi (0,1 līdz 2,0 %);
Nosver apmēram 1 g nesamalta parauga ar precizitāti līdz 0,01 g, ko pārnes 200 ml tilpuma koniskā kolbā. Pievieno 15,0 ml ūdens, samaisa un atstāj uz 5 minūtēm. Pievieno 35,0 ml metanola un acetonitrila maisījuma (3.5.), kolbu noslēdz ar aizbāzni un uz 30 minūtēm ievieto kratītājā vai maisa ar magnētisko maisītāju (4.1.). Šķīdumu filtrē caur stiklašķiedras filtrpapīru (4.2.). Ar pipeti filtrāta alikvotu pārnes 50 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno 15,0 ml ūdens, uzpilda līdz zīmei ar metanola un acetonitrila maisījumu (3.5.) un sajauc. Karbadoksa koncentrācijai pagatavotajā šķīdumā jābūt apmēram 10 μg/ml. Alikvotu filtrē caur 0,45 μm filtru (4.6.). Veic AEŠH mērījumus (5.4.).
5.2.3. Preparāti (> 2 %).
Nosver apmēram 0,2 g nemalta parauga ar precizitāti līdz 0,001 g, ko pārnes uz 250 ml tilpuma konisko kolbu. Pievieno 45,0 ml ūdens, sajauc un atstāj uz 5 minūtēm. Pievieno 105,0 ml metanola un acetonitrila maisījuma (3.5.), kolbu noslēdz ar aizbāzni un tās saturu homogenizē. Paraugu 15 minūtes apstrādā ar ultraskaņu ultraskaņas vannā (4.7.), pēc tam 15 minūtes krata vai maisa (4.1.). Šķīdumu filtrē caur stiklašķiedras filtrpapīru (4.2.). Filtrāta alikvotu atšķaida ar ūdens–metanola–acetonitrila maisījumu (3.12.) līdz karbadoksa koncentrācijai 10–15 μg/ml (10% preparātiem filtrātu atšķaida 10 reizes). Alikvotu filtrē caur 0,45 μm filtru (4.6.). Veic AEŠH mērījumus (5.4.).
5.3. Attīrīšana:
5.3.1. Alumīnija oksīda kolonnas sagatavošana;
Nosver 4 g alumīnija oksīda (3.4.) un pārnes stikla kolonnā (4.3.).
5.3.2. Parauga attīrīšana.
15 ml filtrētā ekstrakta (5.2.1.) pārnes alumīnija oksīda kolonnā un pirmos 2 ml eluāta izlej. Nākamos 5 ml eluāta savāc un tā alikvotu filtrē caur 0,45 μm filtru (4.6.). Veic AEŠH mērījumus (5.4.).
5.4. AEŠH noteikšana:
5.4.1.1. Kritēriji;
Ieteicams ievērot šādus nosacījumus:
|
Šķidruma hromatogrāfijas kolonna (4.1.1): Kustīgā fāze (3.10): Plūsmas ātrums: Viļņa garums noteikšanai: Ievadītais tilpums: |
300 mm x 4 mm, C18, 10 μm pakojums vai līdzvērtīgs Acetāta buferšķīduma (3.9) un acetonitrila (3.2) maisījums 825 + 175 (v + v). 1,5–2 ml/min. 365 nm. 20 μl. |
5.4.1.2. Var izmantot arī citus nosacījumus, ja tie dod līdzvērtīgus rezultātus. Pārbauda hromatogrāfijas sistēmas stabilitāti, vairākas reizes ievadot kalibrēšanas šķīdumu (3.11.2.) ar koncentrāciju 5,0 μg/ml, līdz sasniedz nemainīgus smailes augstumu (vai laukumu) un aiztures laiku.
5.4.2. Kalibrēšanas grafiks;
Visus kalibrēšanas šķīdumus (3.11.2.) ievada vairākas reizes un izmēra katrai koncentrācijai atbilstošo pīķa augstumu (laukumu). Konstruē kalibrēšanas līkni, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu smaiļu vidējo augstumu (vai laukumu) un uz abscisu ass– attiecīgo koncentrāciju μg/ml.
5.4.3. Parauga šķīdums.
Vairākas reizes ievada parauga ekstraktu [(5.3.2.) barībai, (5.2.2.) premiksiem un (5.2.3.) preparātiem] un nosaka karbadoksa smaiļu vidējo augstumu (vai laukumu).
6. Rezultātu aprēķināšana
Izmantojot kalibrēšanas grafiku (5.4.2.), pēc karbadoksa pīķu vidējā augstuma (vai laukuma) nosaka parauga šķīduma koncentrāciju μg/ml.
6.1. Barība
Karbadoksa saturu w (mg/kg) paraugā aprēķina pēc šādas formulas:
5.2.2 (premiksi) vai 5.2.3 (preparāti).
m = analizējamā parauga masa g.
7. Rezultātu izvērtējums
7.1. Identifikācija:
Nosakāmās vielas identitāti var apstiprināt paralēlā hromatogrāfiskajā analīzē vai lietojot diodu matricas detektoru, ar kura palīdzību salīdzina parauga ekstrakta spektru ar tā kalibrēšanas šķīduma (3.11.2.) spektru, kas satur 10,0 μg/ml.
7.1.1. Paralēla hromatogrāfiskā analīze;
Parauga ekstraktam pievieno attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.11.2.). Pievienotā karbadoksa daudzumam būtu jābūt aptuveni vienādam ar parauga ekstraktā noteikto karbadoksa daudzumu.
Ņemot vērā pievienoto daudzumu un atšķaidījumu, būtu jāpalielinās tikai karbadoksa smailes augstumam. Smailes pusaugstuma platums nedrīkst mainīties vairāk par 10%, salīdzinot ar sākotnējo platumu.
7.1.2. Noteikšana ar diodu matricas detektoru.
Rezultātus vērtē pēc šādiem kritērijiem:
a) parauga maksimālās absorbcijas viļņa garumam un standarta spektram, ko reģistrē smailes virsotnē hromatogrammā, detektēšanas sistēmas izšķirtspējas noteiktajās robežās ir jābūt vienādiem. Diodu matricas detektoram šīs robežas parasti ir ± 2 nm;
b) no 225 līdz 400 nm parauga un standarta spektri, kas reģistrēti hromatogrammas smailes virsotnē, nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kurās relatīvā absorbcija ir 10 līdz 100%. Atbilstība šim kritērijam ir ievērota, ja maksimumi sakrīt un nevienā novērojumu punktā novirze starp abiem spektriem nepārsniedz 15% no nosakāmās vielas standarta absorbcijas;
c) no 225 līdz 400 nm parauga ekstrakta kāpuma, virsotnes un krituma smailes spektri cits no cita nedrīkst atšķirties tajās spektra daļās, kurās relatīvā absorbcija ir no 10 līdz 100%. Atbilstība šim kritērijam ir ievērota, ja maksimumi sakrīt un ja nevienā novērojumu punktā spektru atšķirības nepārsniedz 15% no absorbcijas vērtības maksimuma virsotnē.
Ja nav atbilstības kādam no šiem kritērijiem, nosakāmās vielas klātbūtne nav apstiprinājusies.
7.2. Atkārtojamība
Ja karbadoksa saturs analizējamajā paraugā ir 10 mg/kg vai augstāks, divu paralēlu analīžu rezultāti nedrīkst atšķirties vairāk par 15% no lielākā rezultāta vērtības.
7.3. Atgūstamība
Tukšā parauga ar piedevu atgūstamībai vajadzētu būt vismaz 90 %.
8. Salīdzinošās testēšanas rezultāti
Tika organizēta starplaboratoriju salīdzinošā testēšana, kurā astoņās laboratorijās analizēja sešus barības paraugus, četrus premiksus un trīs preparātus. Visus paraugus analizēja divas reizes. (Sīkāku informāciju par šīs starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas rezultātiem sk. Journal of AOAC, Volume 71, 1988, p. 484–490). Analīžu rezultāti (izņemot izkritušos) apkopoti tabulā:
1. tabula. Barības analīžu starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas rezultāti
|
1. paraugs |
2. paraugs |
3. paraugs |
4. paraugs |
5. paraugs |
6. paraugs |
|
|
L n vidējā vērtība (mg/kg) sr (mg/kg) CVr (%) sR (mg/kg) CVR (%) |
8 15 50,0 2,90 5,8 3,92 7,8 |
8 14 47,6 2,69 5,6 4,13 8,7 |
8 15 48,2 1,38 2,9 2,23 4,6 |
8 15 49,7 1,55 3,1 2,58 5,2 |
8 15 46,9 1,52 3,2 2,26 4,8 |
8 15 49,7 2,12 4,3 2,44 4,9 |
|
Nominālais saturs (mg/kg) |
50,0 |
50,0 |
50,0 |
50,0 |
50,0 |
50,0 |
2. tabula. Premiksu un preparātu analīžu starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas rezultāti
|
Premiksi |
Preparāti. |
||||||
|
A |
B |
C |
D |
A |
B |
C |
|
|
L n Vidējā vērtība (g/kg) Sr (g/kg) CVr (%) SR (g/kg) CVR (%) |
7 14 8,89 0,37 4,2 0,37 4,2 |
7 14 9,29 0,28 3,0 0,28 3,0 |
7 14 9,21 0,28 3,0 0,40 4,3 |
7 14 8,76 0,44 5,0 0,55 6,3 |
8 16 94,6 4,1 4,3 5,4 5,7 |
8 16 98,1 5,1 5,2 6,4 6,5 |
8 16 104 7,7 7,4 7,7 7,4 |
|
Nominālais saturs (g/kg) |
10,0 |
10,0 |
10,0 |
10,0 |
100 |
100 |
100 |
|
L laboratoriju skaits n atsevišķo vērtību skaits sr atkārtojamības standartnovirze CVr atkārtojamības variācijas koeficients SR reproducējamības standartnovirze CVR reproducējamības variācijas koeficients |
|||||||
Zemkopības ministrs M.Roze
42.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Nātrija lasalocīda noteikšana
Streptomyces lasaliensis producētās poliētermonokarbonskābes nātrija sāls
1. Mērķis un darbības joma
Ar šo metodi nosaka nātrija lasalocīda saturu barībā un premiksos. Metodes kvalitatīvās noteikšanas robeža ir 5 mg/kg, kvantitatīvās noteikšanas robeža– 30 mg/kg.
2. Princips
Nātrija lasalocīdu no parauga ekstrahē ar paskābinātu metanolu un nosaka ar augstas efektivitātes šķidrumu hromatogrāfijas (AEŠH) metodi, izmantojot spektrofluorimetrisko detektoru.
3. Reaģenti
3.1. Kālija dihidrogēnfosfāts (KH2PO4)
3.2. Ortofosforskābe– w = 85%
3.3. Ortofosforskābes šķīdums– = 20 %
Atšķaida 23,5 ml ortofosforskābes (3.2) ar ūdeni līdz 100 ml
3.4. 6–metil–2–heptilamīns (1,5–dimetilheksilamīns)– w=99%
3.5. Metanols, AEŠH kvalitātes
3.6. Sālsskābe– 20 = 1,19 g/ml
3.7. Fosfāta buferšķīdums– c=0,01 mol/l
Izšķīdina 1,36 g KH2PO4 (3.1.) 500 ml ūdens (3.11.), pievieno 3,5 ml ortofosforskābes (3.2) un 10 ml 6–metil–2–heptilamīna (3.4.). Ar ortofosforskābes šķīdumu (3.3.) ieregulē pH 4,0 un atšķaida ar ūdeni (3.11.) līdz 1000 ml.
3.8. Paskābināts metanols
1000 ml mērkolbā pārnes 5,0 ml sālsskābes (3.6.), uzpilda līdz zīmei ar metanolu (3.5.) un samaisa. Šo šķīdumu pagatavo tieši pirms lietošanas.
3.9. AEŠH kustīgā fāze, fosfāta buferšķīduma– metanola maisījums 5+95 (v+v)
Samaisa 5 ml fosfāta buferšķīduma (3.7.) ar 95 ml metanola (3.5.).
3.10. Nātrija lasalocīda standartviela ar garantētu tīrību, C34H53O8Na (Streptomyces lasaliensis producētās poliētermonokarbonskābes nātrija sāls), E763:
3.10.1. Nātrija lasalocīda izejas standartšķīdums– 500 μg/ml;
Ar precizitāti līdz 0,1 mg iesver 50 mg nātrija lasalocīda (3.10.) 100 ml mērkolbā, izšķīdina paskābinātā metanolā (3.8.), uzpilda līdz zīmei ar to pašu šķīdinātāju un samaisa. Šo šķīdumu pagatavo tieši pirms lietošanas.
3.10.2. Nātrijas lasalocīda darba standartšķīdums– 50 μg/ml;
Ar pipeti pārnes 10,0 ml izejas standartšķīduma (3.10.1.) 100 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar paskābinātu metanolu (3.8.) un samaisa. Šo šķīdums pagatavo tieši pirms lietošanas.
3.10.3. Kalibrēšanas šķīdumi.
Attiecīgi 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0, 5,0 un 10,0ml darba standartšķīduma (3.10.2) pārnes 50ml mērkolbu sērijā. Uzpilda līdz zīmei ar paskābinātu metanolu (3.8) un samaisa. Šie šķīdumi atbilst attiecīgi 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 un 10,0 µg nātrija lasalocīda uz ml. Šos šķīdumus pagatavo tieši pirms lietošanas.
3.11. Ūdens, AEŠH kvalitātes
4. Aparatūra
4.1. Ultraskaņas vanna (vai kratītājs– ūdens vanna) ar regulējamu temperatūru
4.2. Membrānfiltrs– 0,22 μm
4.3. Augstas efektivitātes šķidrumu hromatogrāfs ar ievadīšanas sistēmu, kas piemērota 20 μl tilpuma ievadīšanai:
4.3.1. Šķidruma hromatogrāfijas kolonna, 125 mm x 4 mm, apgrieztās fāzes C18, 5µm pildījums vai tai līdzvērtīga;
4.3.2. Spektrofluorimetrs ar maināmu viļņa garumu ierosināšanai un emisijai.
5. Procedūra
5.1. Vispārīgi noteikumi:
5.1.1. Tukšā parauga analīze;
Atgūstamības pārbaudes (5.1.2.) veikšanai analizē barības tukšo paraugu, lai pārbaudītu, vai paraugā nav nātrija lasalocīda vai traucējošu vielu. Tukšajam paraugam būtu jābūt līdzīgam analizējamajam paraugam pēc veida, un tas nedrīkst saturēt nātrija lasalocīdu vai traucējošas vielas.
5.1.2. Atgūstamības pārbaude.
5.1.2.1. Atgūstamības pārbaudi veic, izmantojot barības tukšo kontrolparaugu ar nātrija lasalocīda piedevu tādā daudzumā, kas ir līdzīgs analizējamajā paraugā esošajam daudzumam. Lai paraugam pievienotu piedevu 100 mg/kg, koniskā 250 ml tilpuma kolbā pārnes 10,0 ml izejas standartšķīduma (3.10.1.), un to ietvaicē līdz apmēram 0,5 ml. Pievieno 50 g barības tukšā parauga, rūpīgi samaisa un pirms ekstrakcijas posma (5.2.) atstāj uz 10 minūtēm, vairākas reizes samaisot.
5.1.2.2. Ja nav pieejams analizējamajam paraugam līdzīgs tukšais paraugs (skatīt 5.1.1.apakšpunktu), atgūstamību nosaka pēc standartpiedevu metodes. Šādā gadījumā analizējamajam paraugam pievieno nātrija lasalocīda daudzumu, kas ir līdzīgs analizējamajā paraugā jau esošajam daudzumam. Šo paraugu analizē kopā ar paraugu bez standartpiedevas un atgūstamību aprēķina pēc starpības.
5.2. Ekstrakcija:
5.2.1. Barība;
250 ml koniskā kolbā ar aizbāzni nosver no 5 līdz 10 g parauga ar precizitāti līdz 0,01 g. Ar pipeti pievieno 100 ml paskābināta metanola (3.8.). Kolbu vaļīgi noslēdz ar aizbāzni un maisa, lai disperģētu. Kolbu uz 20 minūtēm ievieto ultraskaņas vannā (4.1.) apmēram 40oC, tad kolbu izņem un atdzesē līdz istabas temperatūrai. Kolbu atstāj apmēram vienu stundu, lai suspendētas daļiņas nogulsnējas, tad šķīduma alikvotu daļu filtrē caur 0,45 µm membrānas filtru (4.2.) piemērotā traukā. Veic AEŠH noteikšanu (5.3.).
5.2.2. Premiksi;
250 ml mērkolbā nosver 2 g nesasmalcināta premiksa ar precizitāti līdz 0,001 g. Pievieno 100,0 ml paskābināta metanola (3.8.) un maisa, lai disperģētu. Kolbu uz 20 minūtēm ievieto ultraskaņas vannā (4.1.) apmēram 40oC, tad kolbu izņem un atdzesē līdz istabas temperatūrai. Atšķaida līdz zīmei ar paskābinātu metanolu (3.8.) un rūpīgi samaisa. Kolbu atstāj apmēram vienu stundu, lai suspendētas daļiņas nogulsnējas, tad šķīduma alikvotu daļu filtrē caur 0,45 µm membrānas filtru (4.2.). Piemērotu dzidrā filtrāta tilpumu atšķaida ar paskābinātu metanolu (3.8.) tā, lai analizējamais beigu šķīdums saturētu aptuveni 4 µg/ml nātrija lasalocīda. Veic AEŠH noteikšanu (5.3.).
5.3. Augstas efektivitātes šķidrumu hromatogrāfija:
5.3.1. Parametri;
Ieteicams ievērot šādus nosacījumus:
|
Šķidruma hromatogrāfijas kolonna (4.3.1): Kustīgā fāze (3.9): Plūsmas ātrums: Detektora viļņu garumi: –ierosināšana –emisija Ievadīšanas tilpums: |
125 mm x 4 mm, apgrieztā fāze C18, 5 µm pakojums vai līdzvērtīga. Fosfāta buferšķīduma (3.7) un metanola (3.5) maisījums 5+95 (v+v). 1,2 ml/min. 310 nm 419 nm 20 μl |
Var strādāt citos apstākļos, ja tie dod līdzvērtīgus rezultātus. Pārbauda hromatogrāfiskās sistēmas stabilitāti, vairākas reizes ievadot kalibrēšanas šķīdumu (3.10.3.), kas satur 4,0 μg/ml, līdz iegūst vienādus smaiļu augstumus (laukumus) un vienādu aiztures laiku.
5.3.2. Kalibrēšanas grafiks;
Katru kalibrēšanas šķīdumu (3.10.3.) ievada vairākas reizes un nosaka katrai koncentrācijai atbilstošo vidējo smailes augstumu (vai laukumu). Konstruē kalibrēšanas līkni, uz ordinātu ass atzīmējot kalibrēšanas šķīdumu vidējo smaiļu augstumu (vai laukumu), un uz abscisu ass– attiecīgās koncentrācijas µg/ml.
5.3.3. Parauga šķīdums.
Vairākas reizes ievada parauga ekstraktu, kas iegūts, kā aprakstīts punktā 5.2.1 vai 5.2.2, ņemot tādu pašu tilpumu kā kalibrēšanas šķīdumiem, un nosaka nātrija lasalocīda smaiļu vidējo augstumu (laukumu).
6. Rezultātu aprēķināšana
Izmantojot kalibrēšanas līkni (5.3.2.), parauga šķīdumā (5.3.3.) pēc nātrija lasalocīda smailes vidējā augstuma (vai laukuma) nosaka nātrija lasalocīda koncentrāciju, μg/ml.
6.1. Barība
Nātrija lasalocīda saturu w (mg/kg) analizējamajā paraugā aprēķina pēc šādas formulas:
7. Rezultātu izvērtējums
7.1. Identifikācija:
7.1.1. Uz spektrofluorimetriju balstītās metodes ir mazāk pakļautas traucējumiem nekā tās, kurās izmanto UV noteikšanu. Analīta identitāti nosaka paralēlā hromatogrāfijā. Paralēla hromatogrāfiskā analīze– parauga ekstraktam (5.2.1. vai 5.2.2.) pievieno attiecīgu daudzumu kalibrēšanas šķīduma (3.10.3.). Pievienotā nātrija lasalocīda daudzumam jābūt aptuveni vienādam ar parauga ekstraktā noteikto daudzumu.
7.1.2. Ņemot vērā pievienoto nātrija lasalocīda daudzumu un ekstrakta atšķaidījumu, būtu jāpalielinās tikai nātrija lasalocīda smailes augstumam. Smailes pusaugstuma platumam jābūt ± 10 % no bezpiedevas parauga ekstrakta nātrija lasalocīda smailes pusaugstuma platuma.
7.2. Atkārtojamība
No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirība nedrīkst pārsniegt:
7.2.1. 15% no lielākās noteiktās vērtības, ja nātrija lasalocīda saturs ir no 30 mg/kg līdz 100 mg/kg
7.2.2. 15 mg/kg, ja nātrija lasalocīda saturs ir no 100 mg/kg līdz 200 mg/kg
7.2.3. 7,5 % no lielākās vērtības, ja nātrija lasalocīda vērtība pārsniedz 200 mg/kg
7.3. Atgūstamība
Barības tukšā parauga ar piedevu atgūstamībai jābūt vismaz 80 %. Premiksa tukšā parauga ar piedevu atgūstamībai jābūt vismaz 90 %.
8. Salīdzinošās testēšanas rezultāti
Tika organizēta starplaboratoriju salīdzinošā testēšana1, kurā 2 premiksus (paraugi 1 un 2) un 5 barības (paraugi 3– 7) analizēja 12 laboratorijās. Rezultāti apkopoti tabulā:
|
Paraugs Nr.1 Premikss vistām |
Paraugs Nr.2 Premikss tītariem |
Paraugs Nr.3 Granulas tītariem |
Paraugs Nr.4 Drupatas vistām |
Paraugs Nr.5 Barība tītariem |
Paraugs Nr.6 Barība mājputniem A |
Paraugs Nr.6 Barība mājputniem B |
|
|
L |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
|
n |
23 |
23 |
23 |
23 |
23 |
23 |
23 |
|
Vidējā vērtība (mg/kg) |
5050 |
16 200 |
76,5 |
78,4 |
92,9 |
48,3 |
32,6 |
|
sr (mg/kg) |
107 |
408 |
1,71 |
2,23 |
2,27 |
1,93 |
1,75 |
|
CVr (%) |
2,12 |
2,52 |
2,24 |
2,84 |
2,44 |
4,00 |
5,37 |
|
sR (mg/kg) |
286 |
883 |
3,85 |
7,32 |
5,29 |
3,47 |
3,49 |
|
CVR (%) |
5,66 |
5,45 |
5,03 |
9,34 |
5,69 |
7,18 |
10,70 |
|
Nominālais saturs (mg/kg) |
5 000* |
16 000* |
80* |
105* |
120* |
50** |
35** |
|
L laboratoriju skaits n atsevišķu vērtību skaits sr atkārtojamības standartnovirze sR reproducējamības standartnovirze CVr atkārtojamības variācijas koeficients CVR reproducējamības variācijas koeficients *– ražotāja uzdotais saturs **– barība gatavota laboratorijā |
|||||||
1 Analyst, 1995, 120, 2175.–2180.lpp.
Zemkopības ministrs M.Roze
43.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Cietes noteikšana (polarimetriskā metode)
1. Mērķis un darbības sfēra
Ar šo metodi nosaka cietes un augstmolekulāras cietes noārdīšanas produktus barībā ar mērķi pārbaudīt atbilstību Komisijas direktīvai 86/174/EEC un Padomes direktīvai 96/25/EC.
2. Princips
2.1. Metode ietver divas noteikšanas. Pirmajā noteikšanā karstu paraugu apstrādā ar atšķaidītu sālsskābi. Pēc dzidrināšanas un filtrēšanas polarimetriski izmēra šķīduma optisko griešanas spēju.
2.2. Otrajā noteikšanā paraugu ekstrahē ar 40% etilspirtu. Pēc filtrāta paskābināšanas ar sālsskābi, dzidrināšanas un filtrēšanas tāpat kā pirmajā noteikšanā izmēra optisko griešanas spēju.
2.3. No abu mērījumu starpības, pareizinot ar zināmu koeficientu, iegūst parauga cietes saturu.
3. Reaģenti
3.1. 25 % (m/m) sālsskābe– d = 1,126g/ml
3.2. 1,128 % (m/V) sālsskābe– koncentrācija ir jāpārbauda, titrējot 0.1 % (m/V) metilsarkanā šķīduma klātbūtnē (šķīdums 94 % (V/V) etilspirtā) ar 0,1 mol/l nātrija hidroksīda šķīdumu (10 ml = 30,94 ml 0,1 mol/l NaOH)
3.3. Kareca šķīdums I: 21,9 g cinka acetāta Zn (CH3COO)2·2H2O un 3 g ledus etiķskābes izšķīdina ūdenī. Uzpilda ar ūdeni līdz 100 ml
3.4. Kareca šķīdums II: 10,6 g kālija ferocianīda K4 [Fe (CN)6]·3H2O izšķīdina ūdenī. Uzpilda ar ūdeni līdz 100 ml
3.5. 40 % (V/V) etilspirts– d = 0,948 g/ml pie 20oC
4. Aparatūra
4.1. 250 ml Erlenmeijera kolba ar standarta šlifa kaklu un atteces dzesinātāju
4.2. Polarimetrs vai saharimetrs
5. Darba gaita
5.1. Parauga sagatavošana
Paraugu sasmalcina tā, lai to var izsijāt caur 0,5 mm lielu, apaļu acu sietu.
5.2. Kopējās optiskās griešanas (P vai S) noteikšana (skatīt piezīmi 7.1.apakšpunktā).
5.2.1. Nosver sasmalcināto paraugu 2,5 g ar precizitāti līdz tuvākajam mg un pārnes uz 100ml mērkolbu. Pievieno 25 ml sālsskābes (3.2.), krata, lai analizējamais paraugs vienmērīgi sadalītos, un pievieno vēl 25 ml sālsskābes (3.2.). Iegremdē kolbu verdoša ūdens vannā, pirmās trīs minūtes enerģiski un nepārtraukti kratot, lai novērstu aglomerātu veidošanos. Ūdens daudzumam ūdens vannā jābūt pietiekamam, lai vanna turpinātu vārīties, kad tajā ieliek kolbu. Kolbu no vannas nedrīkst izņemt, kad tā tiek kratīta. Precīzi pēc 15 minūtēm kolbu izņem no vannas, pievieno 30 ml auksta ūdens un tūlīt atdzesē līdz 20oC.
5.2.2. Pievieno 5 ml Kareca šķīduma I (3.3.) un vienu minūti krata. Pēc tam pievieno 5 ml Kareca šķīduma II (3.4.) un vēlreiz vienu minūti krata. Uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē. Ja filtrāts nav pilnīgi dzidrs (to novēro reti), atkārto noteikšanu, izmantojot lielāku Kareca šķīduma I un Kareca šķīduma II daudzumu, piemēram, 10 ml.
5.2.3. Ar polarimetru vai saharimetru izmēra šķīduma optisko griešanu 200 mm kivetē.
5.3. Optiskās griešanas (P vai S) noteikšana 40 % etilspirtā šķīstošām vielām
5.3.1. Nosver 5 g parauga ar precizitāti līdz tuvākajam mg, pārnes uz 100 ml mērkolbu un pievieno aptuveni 80 ml etilspirta (3.5.) (skatīt piezīmi 7.2.apakšpunktā). Atstāj kolbu 1 stundu istabas temperatūrā. Šajā laikā sešas reizes enerģiski sakrata kolbu tā, lai analizējamais paraugs labi sajauktos ar etilspirtu. Uzpilda ar etilspirtu (3.5.) līdz atzīmei, samaisa un filtrē.
5.3.2. 50 ml filtrāta (= 2,5 g parauga) ar pipeti pārnes uz 250 ml Erlenmeijera kolbu, pievieno 2,1 ml sālsskābes (3.1.) un enerģiski sakrata. Erlenmeijera kolbai uzliek dzesinātāju un kolbu iegremdē verdoša ūdens vannā. Precīzi pēc 15 minūtēm izņem Erlenmeijera kolbu no ūdens vannas, saturu pārnes uz 100 ml mērkolbu, skalojot ar nelielu daudzumu auksta ūdens, un atdzesē līdz 20oC.
5.3.3. Izmantojot Kareca šķīdumu I (3.3.) un Kareca šķīdumu II (3.4.), dzidrina, uzpilda līdz zīmei ar ūdeni, samaisa, filtrē un izmēra optisko griešanu, kā norādīts 5.2. apakšpunkta otrajā un trešajā rindkopā.
6. Rezultātu aprēķināšana
Cietes saturu procentos aprēķina, izmantojot šādu formulu:
6.1. Ar polarimetru veiktajiem mērījumiem:
7. Piezīmes
7.1. Ja paraugs satur vairāk kā 6 % karbonātu, rēķinot uz kalcija karbonātu, tie pirms kopējās optiskās griešanas noteikšanas ir jāsadala, apstrādājot ar precīzi atbilstošu atšķaidītas sērskābes daudzumu
7.2. Ja produktos ir liels laktozes saturs, tādos kā piena pulveris vai vājpiena pulveris, pēc 80 ml etilspirta (3.5.) pievienošanas rīkojas šādi: Erlenmeijera kolbai pievieno atteces dzesinātāju un kolbu uz 30 minūtēm iegremdē ūdens vannā pie 50oC. Atstāj atdzist un turpina analīzi, kā norādīts 5.3.apakšpunktā.
Zemkopības ministrs M.Roze
44.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
A vitamīna noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
1.1. Ar šo metodi nosaka A vitamīnu (retinolu) barībā. Ar A vitamīnu saprot all-trans-retinilspirtu un tā cis izomērus. A vitamīna saturu izsaka starptautiskajās vienībās (s.v.) uz kg. Viena s.v. atbilst 0,300 μg all-trans- A vitamīna spirta vai 0,344 µg all-trans- A vitamīna acetāta, vai arī 0,550 µg all-trans- A vitamīna palmitāta aktivitātei.
1.2. Mazākais nosakāmais daudzums ir 2000 s.v. A vitamīna/kg.
2. Princips
Paraugu ar kālija hidroksīda šķīdumu hidrolizē etanolā un A vitamīnu ekstrahē petrolēterī. Šķīdinātāju iztvaicē un atlikumu šķīdina metanolā (vajadzības gadījumā atšķaida līdz nepieciešamajai koncentrācijai). A vitamīna saturu nosaka ar apgrieztās fāzes augstas efektivitātes šķidruma hromatogrāfiju (AEŠH), izmantojot UV vai fluorescences detektoru. Hromatogrāfiskos parametrus izvēlas tā, lai all-trans- A vitamīna spirts neatdalās no tā cis izomēriem.
3. Reaģenti
3.8. 2–propanols;
3.9. AEŠH kustīgā fāze: metanola (3.3.) un ūdens maisījums, piemēram, 980 + 20 (v + v). Precīza attiecība ir atkarīga no izmantotās kolonnas īpašībām;
3.10. Slāpeklis bez skābekļa;
3.11. All-trans- A vitamīna acetāts, īpaši tīrs ar sertificētu aktivitāti, piemēram, 2,80 x 106 s.v. /g. All-trans- A vitamīna acetāta pamatšķīdums: ar precizitāti līdz 0,1 mg 100 ml mērkolbā nosver 50 mg A vitamīna acetāta (3.11.), izšķīdina 2–propanolā (3.8.) un uzpilda līdz atzīmei ar to pašu šķīdinātāju. Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 1400 s.v. A vitamīna /ml. Precīzais saturs jānosaka saskaņā ar 5.6.3.1.;
3.12. All-trans- A vitamīna palmitāts– īpaši tīrs ar sertificētu aktivitāti, piemēram, 1,80 x 106 s.v. /g. All-trans- A vitamīna palmitāta pamatšķīdums: ar precizitāti līdz 0,1 mg, 100 ml mērkolbā nosver 80 mg A vitamīna palmitāta (3.12.), izšķīdina 2–propanolā (3.8.) un uzpilda līdz atzīmei ar to pašu šķīdinātāju. Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 1400 s.v. A vitamīna uz ml. Precīzais saturs jānosaka saskaņā ar 5.6.3.2.;
3.13. 2,6 di–terc–butil–4 metilfenols (BHT) (skat. novērojumu 7.5.).
4. Iekārtas
4.1. Rotācijas vakuumietvaicētājs;
4.2. Brūnā stikla trauki:
4.2.1. plakandibena vai koniskā 500 ml kolba ar pieslīpētu stikla (šlifa) aizbāzni;
4.2.2. mērkolba ar šauru kaklu un pieslīpētu stikla aizbāzni, ar 10, 25, 100 un 500 ml tilpumu;
4.2.3. koniska dalāmā piltuve ar pieslīpētu stikla aizbāzni un 1000 ml tilpumu;
4.2.4. bumbierveida kolba ar pieslīpētu stikla aizbāzni un 250 ml tilpumu;
4.3. Alīna dzesinātājs ar pieslīpētu stikla savienojumu un adapteri gāzu padeves caurulei, tā ārējais garums 300 mm;
4.4. kroku filtrs fāžu atdalīšanai ar 185 mm diametru (piemēram, Schleicher & Schuell 597 HY ½);
4.5. AEŠH iekārta ar ievadīšanas sistēmu:
4.5.1. šķidruma hromatogrāfijas kolonna– 250 mm x4 mm, C18, 5 vai 10 μm pakojums vai līdzvērtīgs (izšķiršanas kritērijs: viena smaile visiem retinola izomēriem);
4.5.2. UV vai fluorescences detektors ar regulējamu viļņu garumu;
4.6. Spektrofotometrs ar 10 mm kvarca šūnām;
4.7. Ūdens vanna ar magnētisko maisītāju;
4.8. Ekstrakcijas iekārta, kas sastāv no:
4.8.1. 1l tilpuma stikla cilindra ar pieslīpētu stikla kaklu un aizbāzni;
4.8.2. pieslīpēta stikla ieliktņa ar sānu nozarojumu un regulējamu cauruli, kas iet caur centru. Lai virsējo šķidruma slāni cilindrā varētu novadīt uz dalāmo piltuvi, tad regulējamajai caurulei ir jābūt ar U veida apakšējo galu un sprauslu pretējā galā.
5. Darba gaita
Piezīme
Vitamīns A ir jutīgs pret (UV) gaismas un oksidētāju iedarbību. Visas darbības jāveic, izvairoties no gaismas klātbūtnes (izmantojot brūna stikla traukus vai stikla traukus, kas ir aizsargāti ar alumīnija foliju), kā arī no skābekļa klātbūtnes (izpūš ar slāpekli). Ekstrakcijas laikā gaiss virs šķidruma jāaizstāj ar slāpekli (periodiski atbrīvojot aizbāzni, lai izvairītos no pārmērīga spiediena).
5.1. Paraugu sagatavošana
Paraugu samaļ tā, lai to var izsijāt caur 1mm lielu acu sietu un malšanas laikā nerastos siltums. Paraugu samaļ tieši pirms svēršanas un pārziepošanas, lai izvairītos no A vitamīna zudumiem.
5.2. Pārziepošana
Atkarībā no A vitamīna satura 500 ml plakandibena vai koniskā kolbā (4.2.1.) paraugam nosver 2 g līdz 25 g ar precizitāti līdz 0,01 g. Maisot pakāpeniski pievieno 130 ml etanola (3.1.), apmēram 100 mg BHT (3.13.), 2 ml nātrija askorbāta šķīduma (3.5.) un 2 ml nātrija sulfīda šķīduma (3.6.). Kolbai pievieno dzesinātāju (4.3.) un iegremdē kolbu ūdens vannā ar magnētisko maisītāju (4.7.). Uzvāra un ļauj vārīties piecas minūtes. Tad caur dzesētāju (4.3.) pievieno 25 ml kālija hidroksīda šķīduma (3.4.) un, maisot lēnā slāpekļa plūsmā, vāra vēl 25 minūtes. Tad izskalo dzesinātāju ar apmēram 20 ml ūdens un kolbas saturu atdzesē līdz istabas temperatūrai.
5.3. Ekstrakcija
Pārziepoto šķīdumu dekantējot kvantitatīvi pārnes 1000 ml dalāmajā piltuvē (4.2.3.) vai ekstrakcijas iekārtā (4.8.), noskalojot ar 250 ml ūdens. Pārziepošanas kolbu pēc kārtas izskalo ar 25 ml etanola (3.1.) un 100 ml petrolētera (3.2.), un noskalojumus pārnes dalāmajā piltuvē vai ekstrakcijas iekārtā. Ūdens un etanola attiecībai kombinētajos šķīdumos būtu jābūt aptuveni 2:1. Enerģiski krata divas minūtes un nostādina divas minūtes.
5.3.1. Ekstrakcija, izmantojot dalāmo piltuvi (4.2.3.)
5.3.1.1. Kad slāņi ir atdalījušies (skatīt novērojumu 7.3.apakšpunktā), petrolētera slāni pārnes uz citu dalāmo piltuvi (4.2.3.). Ekstrakciju atkārto divas reizes ar 100 ml petrolētera (3.2.) un divas reizes ar 50 ml petrolētera (3.2.).
5.3.1.2. Kombinētos ekstraktus viegli maisot, lai neveidotos emulsija, divas reizes mazgā dalāmajā piltuvē ar 100 ml ūdens, tad, kratot atkārto ar jaunām 100 ml ūdens porcijām, līdz ūdens, pievienojot fenolftaleīna šķīdumu (3.7.), kļūst bezkrāsains (parasti pietiek ar četrām mazgāšanas reizēm). Lai atdalītu suspendēto ūdeni, mazgāto ekstraktu caur sausu kroku filtru fāžu atdalīšanai (4.4.) filtrē 500 ml mērkolbā (4.2.2.). Dalāmo piltuvi un filtru noskalo ar 50 ml petrolēteri (3.2.), uzpilda līdz atzīmei ar petrolēteri (3.2.) un rūpīgi samaisa.
5.3.2. Ekstrakcija, izmantojot ekstrakcijas iekārtu (4.8.)
5.3.2.1. Kad slāņi ir atdalījušies (skat. novērojumu 7.3.), stikla cilindra (4.8.1.) aizbāzni nomaina ar pieslīpēta stikla ieliktni (4.8.2.) un regulējamās caurules U veida galu novieto tā, lai tas atrastos tieši virs slāņu saskares līmeņa. Caur sānu nozarojumu, ar spiedienu ievadot slāpekli, augšējo petrolētera slāni pārnes 1000 ml dalāmajā piltuvē (4.2.3.). Stikla cilindrā pievieno 100 ml petrolētera (3.2.), aizdara ar aizbāzni un kārtīgi sakrata. Ļauj slāņiem atdalīties un pārnes augšējo slāni uz to pašu dalāmo piltuvi. Atkārto ekstrakciju ar nākamajiem 100 ml petrolētera (3.2.), tad divas reizes ar 50 ml petrolētera (3.2.), un petrolētera slāņus pārnes uz dalāmo piltuvi.
5.3.2.2. Kombinētos petrolētera ekstraktus mazgā tā, kā aprakstīts 5.3.1.apakšpunktā, un turpina rīkoties saskaņā ar šo punktu.
5.4. Parauga šķīduma sagatavošana mērījumiem ar AEŠH
Alikvotu porciju petrolētera šķīduma (5.3.1. vai 5.3.2.) ar pipeti pārnes uz 250 ml bumbierveida kolbu (4.2.4.). Rotācijas ietvaicētājā samazinātā spiedienā ūdens vannas temperatūrā, kas nepārsniedz 40°C, iztvaicē šķīdinātāju, līdz gandrīz sauss. Atjauno atmosfēras spiedienu, pievienojot slāpekli (3.10.) un izņem kolbu no rotācijas ietvaicētāja. Atlikušo šķīdinātāju aizvāc ar slāpekļa (3.10.) plūsmu un nekavējoties izšķīdina atlikumu zināmā tilpumā (10–100 ml) metanola (3.3.) (A vitamīna koncentrācijai būtu jābūt no 5 s.v./ml līdz 30 s.v./ml).
5.5. Noteikšana ar AEŠH
5.5.1. A vitamīnu atdala C18 apgrieztās fāzes kolonnā (4.5.1.) un koncentrāciju izmēra ar UV detektoru (325 nm) vai fluorescences detektoru (ierosināšana: 325 nm, emisija: 475 nm) (4.5.2.).
5.5.2. Hromatogrāfā ievada alikvotu porciju (piem. 20 μl) metanola šķīduma, kas iegūts tā, kā aprakstīts 5.4. apakšpunktā un izskalo ar kustīgo fāzi (3.9.). Aprēķina vairāku viena parauga šķīduma injekcijas smaiļu vidējo augstumu (platību) un vairāku kalibrēšanas šķīdumu (5.6.2.) injekcijas smaiļu vidējo augstumu (platību).
AEŠH parametri
Paraugam piedāvā šādus parametrus:
|
Šķidruma hromatogrāfijas kolonna (4.5.1.) |
250 mm x 4 mm, C18, 5 vai 10 μm pakojums vai līdzvērtīgs |
|
Kustīgā fāze (3.9.) |
Metanola (3.3.) un ūdens maisījums, piemēram, 980 + 20 (v + v) |
|
Plūsmas ātrums |
1–2 ml/min. |
|
Detektors (4.5.2.) |
UV detektors (325 nm) vai fluorescences detektors (ierosināšana: 325 nm/emisija 475 nm) |
Var izmantot citus parametrus, ja tie sniedz līdzvērtīgus rezultātus.
5.6. Kalibrēšana
5.6.1. Darba standartšķīdumu sagatavošana;
5.6.1.1. 20 ml A vitamīna acetāta pamatšķīduma (3.11.) vai 20 ml A vitamīna palmitāta pamatšķīduma (3.12.) ar pipeti pārnes uz 500 ml plakandibena vai konisko kolbu (4.2.1.) un hidrolizē, kā norādīts 5.2.apakšpunktā, nepievienojot BHT. Pēc tam ekstrahē ar petrolēteri (3.2.) saskaņā ar 5.3.apakšpunktu un uzpilda ar petrolēteri (3.2.) līdz atzīmei. Rotācijas ietvaicētājā iztvaicē 100 ml šī ekstrakta (skat. 5.4.), līdz gandrīz sauss, ar slāpekļa (3.10.) plūsmu aizvāc atlikušo šķīdinātāju un atkārtoti šķīdina atlikumu 10,0 ml metanola (3.3.). Šī šķīduma nominālā koncentrācija ir 560 s.v. A vitamīna uz mililitru. Precīzu saturu nosaka saskaņā ar 5.6.3.3. Standarta darba šķīdumu sagatavo tieši pirms lietošanas.
5.6.1.2. 2,0 ml šā standarta darba šķīduma ar pipeti pārnes uz 20 ml mērkolbu, uzpilda ar metanolu (3.3.) līdz atzīmei un sajauc. Šā atšķaidītā darba standartšķīduma nominālā koncentrācija ir 56 s.v. A vitamīna uz mililitru.
5.6.2. Kalibrēšanas šķīdumu un kalibrēšanas grafika sagatavošana;
5.6.2.1. 1,0, 2,0, 5,0 un 10,0 ml atšķaidīta darba standartšķīduma pārnes uz 20 ml mērkolbu rindu, uzpilda ar metanolu (3.3.) līdz zīmei un sajauc. Šo šķīdumu nominālās koncentrācijas ir 2,8, 5,6, 14,0, un 28,0 s.v. A vitamīna uz mililitru.
5.6.2.2. 20 μl katra kalibrēšanas šķīduma ievada hromatogrāfā vairākas reizes un nosaka smaiļu vidējo augstumu (platību). Izmantojot smaiļu vidējos augstumus (platības), izveido kalibrēšanas grafiku, kas satur UV kontroles (5.6.3.3.) rezultātus.
5.6.3. Standartšķīdumu UV standartizācija:
5.6.3.1. A vitamīna acetāta pamatšķīdums;
5.6.3.1.1. 2,0 ml A vitamīna acetāta pamatšķīduma (3.11.) ar pipeti pārnes uz 50 ml mērkolbu (4.2.2.) un uzpilda ar 2–propanolu (3.8.) līdz atzīmei. Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 56 s.v. A vitamīna uz mililitru. 3,0 ml atšķaidītā A vitamīna šķīdumu ar pipeti pārnes uz 25 ml mērkolbu un uzpilda ar 2–propanolu (3.8.) līdz atzīmei. Šī šķīduma nominālā koncentrācija ir 6,72 s.v. A vitamīna uz mililitru. Spektrofotometrā uzņem šī šķīduma UV spektru pret 2–propanolu (3.8.) intervālā no 300 nm līdz 400 nm. Absorbcijas maksimumam ir jābūt starp 325 nm un 327 nm.
5.6.3.1.2. A vitamīna satura aprēķināšana:
A vitamīna s.v./ml = E326 x 19,0
(E 1%1 cm A vitamīna acetātam = 1530 pie 326 nm 2–propanolā)
5.6.3.2. A vitamīna palmitāta pamatšķīdums;
5.6.3.2.1. 2,0 ml A vitamīna acetāta paamtšķīduma (3.12.) ar pipeti pārnes uz 50 ml mērkolbu (4.2.2.) un uzpilda ar 2–propanolu (3.8.) līdz atzīmei. Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 56 s.v. A vitamīna uz mililitru. 3,0 ml atšķaidītā A vitamīna šķīdumu ar pipeti pārnes uz 25 ml mērkolbu un uzpilda ar 2–propanolu (3.8.) līdz atzīmei. Šī šķīduma nominālā koncentrācija ir 6,72 s.v. A vitamīna uz mililitru. Spektrofotometrā uzņem šī šķīduma UV spektru pret 2–propanolu (3.8.) intervālā no 300 nm līdz 400 nm. Absorbcijas maksimumam ir jābūt starp 325 nm un 327 nm.
5.6.3.2.2. A vitamīna satura aprēķināšana:
A vitamīna s.v./ml = E326 x 19,0
(E 1%1 cm A vitamīna palmitātam=957 pie 326 nm 2–propanolā)
5.6.3.3. A vitamīna darba standartšķīdums
5.6.3.3.1. 3,0 ml neatšķaidītu A vitamīna darba standartšķīduma, kurš sagatavots saskaņā ar 5.6.1, ar pipeti pārnes uz 50 ml mērkolbu (4.2.2.) un uzpilda ar 2–propanolu (3.8.) līdz atzīmei. 5,0 ml atšķaidītā šķīduma ar pipeti pārnes uz 25 ml mērkolbu un uzpilda ar 2–propanolu (3.8.) līdz atzīmei. Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 6,72 s.v. A vitamīna uz mililitru. Spektrofotometrā uzņem šī šķīduma UV spektru pret 2–propanolu (3.8.) intervālā no 300 nm līdz 400 nm. Absorbcijas maksimumam ir jābūt starp 325 nm un 327 nm.
5.6.3.3.2. A vitamīna satura aprēķināšana:
A vitamīna s.v./ ml = E325 x 18,3
(E 1%1 cm vitamīna A spirtam=1821 pie 325 nm 2–propanolā)
6. Rezultātu aprēķināšana
6.1. Izmantojot A vitamīna vidējos smaiļu augstumus (platības) parauga šķīdumā no kalibrēšanas grafika (5.6.2.), nosaka parauga šķīduma koncentrāciju s.v. / ml.
6.2. A vitamīna saturu w paraugā s.v. /kg aprēķina, izmantojot šādu formulu:
V1 = parauga šķīduma (5.4) tilpums ml
V2 = 5.4 ņemtā alikvota tilpums ml
m = analizētā parauga svars g
7. Novērojumi
7.1. Paraugiem ar zemu A vitamīna koncentrāciju būtu derīgi apvienot petrolētera ekstraktus no divām pārziepošanas reizēm (svērtais daudzums 25 g vienam AEŠH parauga šķīdumam);
7.2. Analīzei ņemtais paraugs nedrīkst saturēt vairāk kā 2 g tauku;
7.3. Ja fāzes neatdalās, pievieno apmēram 10 ml etanola (3.1.), lai izjauktu emulsiju;
7.4. Mencu aknu eļļai un citiem tīriem taukiem pārziepošanas laiks ir jāpagarina līdz 45–60 minūtēm;
7.5. BHT vietā var izmantot hidrohinonu;
7.6. Izmantojot normālās fāzes kolonnu, var atdalīt retinola izomērus;
7.7. Askorbāta šķīduma vietā var izmantot apmēram 150 mg askorbīnskābes;
7.8. Nātrija sulfīda šķīduma vietā var izmantot apmēram 50 mg EDTA.
8. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 15% no lielākā rezultāta.
9. Salīdzinošā pētījuma rezultāti1
|
Premikss |
Barības premikss |
Minerālvielu koncentrāts |
Olbaltumvielu barība |
Barība sivēniem |
|
|
L: |
13 |
12 |
13 |
12 |
13 |
|
n |
48 |
45 |
47 |
46 |
49 |
|
vidējais [s.v. /kg] |
17,02 x 106 |
1,21 x 106 |
537100 |
151800 |
18070 |
|
sr [s.v./kg] |
0,51 x 106 |
0,039 x 106 |
22080 |
12280 |
682 |
|
r [s.v./kg] |
1,43 x 106 |
0,109 x 106 |
61824 |
34384 |
1910 |
|
CVr [%] |
3,0 |
3,5 |
4,1 |
8,1 |
3,8 |
|
sR [s.v./kg] |
1,36 x 106 |
0,069 x 106 |
46300 |
23060 |
3614 |
|
R [s.v. /kg] |
3,81 x 106 |
0,193 x 106 |
129640 |
64568 |
10119 |
|
CVR [%] |
8,0 |
6,2 |
8,6 |
15 |
20 |
|
L: laboratoriju skaits n: atsevišķu vērtību skaits sr: atkārtojamības standarta novirze sR: reproducējamības standarta novirze r: atkārtojamība R reproducējamība CVr: atkārtojamības variāciju koeficients CVR: reproducējamības variāciju koeficients |
|||||
1 Veikusi Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs– und Forschungsanstalten (VDLUFA) darba grupa
Zemkopības ministrs M.Roze
45.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
E vitamīna noteikšana
1. Mērķis un darbības sfēra
1.1. Ar šo metodi nosaka E vitamīnu barībā. E vitamīna saturu izsaka kā
DL–α –tokoferola acetātu mg uz kg. 1mg
DL–α –tokoferola acetāta atbilst 0,91 mg
DL–α –tokoferolam (vitamīnam E).
1.2. Mazākais nosakāmais daudzums ir 2mg E vitamīna/ kg.
2. Princips
Paraugu ar kālija hidroksīda šķīdumu hidrolizē etanolā un E vitamīnu ekstrahē petrolēterī. Šķīdinātāju iztvaicē, atlikumu šķīdina metanolā un, ja vajadzīgs, atšķaida līdz nepieciešamajai koncentrācijai. E vitamīna saturu nosaka ar apgrieztās fāzes augstas izšķiršanas šķidruma hromatogrāfiju (AF–AEŠH), izmantojot fluorescences vai UV detektoru.
3. Reaģenti
4. Iekārta
4.1. Rotācijas vakuumietvaicētājs;
4.2. Brūnā stikla trauki:
4.2.1. plakandibena vai koniskā 500 ml kolba ar pieslīpētu stikla (šlifa) aizbāzni;
4.2.2. mērkolba ar šauru kaklu un pieslīpētu stikla aizbāzni, ar 10, 25, 100 un 500 ml tilpumu;
4.2.3. koniska dalāmā piltuve ar pieslīpētu stikla aizbāzni un 1000 ml tilpumu;
4.2.4. bumbierveida kolba ar pieslīpētu stikla aizbāzni un 250 ml tilpumu;
4.3. Alīna dzesinātājs ar pieslīpētu stikla savienojumu un adapteri gāzu padeves caurulei, tā ārējais garums 300 mm;
4.4. kroku filtrs fāžu atdalīšanai ar 185 mm diametru (piemēram, Schleicher & Schuell 597 HY ½)
4.5. AEŠH iekārta ar ievadīšanas sistēmu:
4.5.1. šķidruma hromatogrāfijas kolonna– 250 mm x 4 mm, C18, 5 vai 10 μm pakojums vai līdzvērtīgs;
4.5.2. UV vai fluorescences detektors ar regulējamu viļņu garumu;
4.6. Spektrofotometrs ar 10 mm kvarca kivetēm;
4.7. Ūdens vanna ar magnētisko maisītāju;
4.8. Ekstrakcijas iekārta, kas sastāv no:
4.8.1. 1l tilpuma stikla cilindra ar pieslīpēta stikla kaklu un aizbāzni;
4.8.2. pieslīpēta stikla ieliktņa ar sānu nozarojumu un regulējamu cauruli, kas iet caur centru. Regulējamajai caurulei ir jābūt U veida apakšējam galam un sprauslai pretējā galā, lai virsējo šķidruma slāni cilindrā varētu novadīt uz dalāmo piltuvi.
5. Darba gaita
Piezīme
Vitamīns E ir jūtīgs pret (UV) gaismu un oksidētāju iedarbību. Visas darbības jāveic, izvairoties no gaismas klātbūtnes (izmantojot brūna stikla traukus vai stikla traukus, kas ir aizsargāti ar alumīnija foliju), kā arī no skābekļa klātbūtnes (izpūš ar slāpekli). Ekstrakcijas laikā gaiss virs šķidruma jāaizstāj ar slāpekli (periodiski atbrīvojot aizbāzni, lai izvairītos no pārmērīga spiediena).
5.1. Paraugu sagatavošana
Paraugu samaļ tā, lai to var izsijāt caur 1 mm lielu acu sietu un malšanas laikā nerastos siltums. Lai izvairītos no E vitamīna zudumiem, paraugu samaļ tieši pirms svēršanas un pārziepošanas.
5.2. Pārziepošana
Atkarībā no E vitamīna satura 500 ml plakandibena vai koniskā kolbā (4.2.1.) paraugam nosver 2 g līdz 25 g ar precizitāti līdz 0,01 g. Maisot pakāpeniski pievieno 130 ml etanola (3.1.), apmēram 100 mg BHT (3.12.), 2 ml nātrija askorbāta šķīduma (3.5.) un 2 ml nātrija sulfīda šķīduma (3.6.). Kolbai pievieno dzesinātāju (4.3.) un iegremdē kolbu ūdens vannā ar magnētisko maisītāju (4.7.). Uzvāra un ļauj vārīties ar atteces dzesinātāju piecas minūtes. Tad caur dzesinātāju (4.3.) pievieno 25 ml kālija hidroksīda šķīduma (3.4.) un, maisot lēnā slāpekļa plūsmā, vāra vēl 25 minūtes. Tad noskalo dzesinātāju ar apmēram 20 ml ūdens un kolbas saturu atdzesē līdz istabas temperatūrai.
5.3. Ekstrakcija
Pārziepoto šķīdumu dekantējot kvantitatīvi pārnes 1000 ml dalāmajā piltuvē (4.2.3.) vai ekstrakcijas iekārtā (4.8.), noskalojot ar 250 ml ūdens. Pārziepošanas kolbu pēc kārtas izskalo ar 25 ml etanola (3.1.) un 100 ml petrolētera (3.2.), un noskalojumus pārnes uz dalāmo piltuvi vai ekstrakcijas iekārtu. Ūdens un etanola attiecībai kombinētajos šķīdumos būtu jābūt aptuveni 2:1. Enerģiski krata divas minūtes un nostādina divas minūtes.
5.3.1. Ekstrakcija, izmantojot dalāmo piltuvi (4.2.3.)
5.3.1.1. Kad slāņi ir atdalījušies (skat. novērojumu 7.3.), petrolētera slāni pārnes uz citu dalāmo piltuvi (4.2.3.). Ekstrakciju divas reizes atkārto ar 100 ml petrolētera (3.2.) un divas reizes– ar 50 mililitriem petrolētera (3.2.).
5.3.1.2. Kombinētos ekstraktus, viegli maisot, lai neveidotos emulsija, divas reizes mazgā dalāmajā piltuvē ar 100 ml ūdens, tad kratot atkārto ar jaunām 100 ml ūdens porcijām, līdz ūdens, pievienojot fenolftaleīna šķīdumu (3.7.), kļūst bezkrāsains (parasti pietiek ar četrām mazgāšanas reizēm). Lai atdalītu suspendētu ūdeni, mazgāto ekstraktu caur sausu kroku filtru fāžu atdalīšanai (4.4.) filtrē 500 ml mērkolbā (4.2.2.). Dalāmo piltuvi un filtru noskalo ar 50 ml petrolētera (3.2), uzpilda līdz atzīmei ar petrolēteri (3.2.) un rūpīgi samaisa.
5.3.2. Ekstrakcija, izmantojot ekstrakcijas iekārtu (4.8.)
5.3.2.1. Kad slāņi ir atdalījušies (skat. novērojumu 7.3.), stikla cilindra (4.8.1.) aizbāzni nomaina ar pieslīpēta stikla ieliktni (4.8.2.) un regulējamās caurules U veida galu novieto tā, lai tas atrastos tieši virs slāņu saskares līmeņa. Caur sānu nozarojumu, ar spiedienu ievadot slāpekli, augšējo petrolētera slāni pārnes 1000 ml dalāmajā piltuvē (4.2.3.). Stikla cilindrā pievieno 100 ml petrolētera (3.2.), aizdara ar aizbāzni un kārtīgi sakrata. Ļauj slāņiem atdalīties un pārnes augšējo slāni uz to pašu dalāmo piltuvi. Atkārto ekstrakciju ar nākamajiem 100 ml petrolētera (3.2.), tad divas reizes ar 50 ml petrolētera (3.2.), un pārnes petrolētera slāņus uz dalāmo piltuvi.
5.3.2.2. Kombinētos petrolētera ekstraktus mazgā tā, kā aprakstīts 5.3.1., un turpina rīkoties saskaņā ar šo punktu.
5.4. Parauga šķīduma sagatavošana mērījumiem ar AEŠH
Alikvotu porciju petrolētera šķīduma (5.3.1. vai 5.3.2.) ar pipeti pārnes uz 250 ml bumbierveida kolbu (4.2.4.). Rotācijas ietvaicētājā samazinātā spiedienā ūdens vannas temperatūrā, kas nepārsniedz 40°C, iztvaicē šķīdinātāju, līdz gandrīz sauss. Pievadot slāpekli (3.10.), atjauno atmosfēras spiedienu un izņem kolbu no rotācijas ietvaicētāja. Atlikušo šķīdinātāju aizvāc ar slāpekļa (3.9.) plūsmu un nekavējoties izšķīdina atlikumu zināmā tilpumā (10–100 ml) metanola (3.3.) (DL–α–tokoferola koncentrācijai būtu jābūt no 5 µg /ml līdz 30µg/ml).
5.5. Noteikšana ar AEŠH
5.5.1. E vitamīnu atdala C18 apgrieztās fāzes kolonnā (4.5.1.) un koncentrāciju izmēra ar fluorescences detektoru (ierosināšana: 295 nm, emisija: 330 nm) vai UV detektoru (292 nm) (4.5.2.).
5.5.2. Hromatogrāfā ievada alikvotu porciju (piemēram, 20 μl) metanola šķīdumā, kas iegūts, kā norādīts 5.4.apakšpunktā, un izskalo ar kustīgo fāzi (3.8.). Aprēķina vairāku viena parauga šķīduma injekciju vidējo smaiļu augstumu (platību) un vairāku kalibrēšanas šķīdumu (5.6.2.) injekciju vidējo smaiļu augstumu (platību).
AEŠH parametri
Paraugam piedāvā šādus parametrus:
|
Šķidruma hromatogrāfijas kolonna (4.5.1.): |
250 mm x 4 mm, C18, 5 vai 10 μm pakojums vai līdzvērtīgs |
|
Kustīgā fāze (3.8.): |
Metanola (3.3.) un ūdens maisījums, piemēram, 980 + 20 (v + v) |
|
Plūsmas ātrums |
1–2 ml/min |
|
Detektors (4.5.2.): |
Fluorescences detektors (ierosināšana: 295 nm/emisija: 330 nm) vai UV detektors (292 nm) |
7. Novērojumi
7.1. Paraugiem ar zemu E vitamīna koncentrāciju var būt lietderīgi kombinēt divu pārziepošanas reižu petrolētera ekstraktus (svērtais daudzums: 25 g vienam parauga šķīdumam noteikšanai ar AEŠH);
7.2. Analīzei ņemtais paraugs nedrīkst saturēt vairāk kā 2 g tauku;
7.3. Ja fāzes neatdalās, pievieno apmēram 10 ml etanola (3.1.), lai izjauktu emulsiju;
7.4. Pēc DL– α – tokoferola acetāta vai DL– α – tokoferola šķīduma spektrofotometriskajiem mērījumiem saskaņā ar 5.6.1.3. vai 5.6.2.3., šķīdumam (3.10.1. vai 3.10.2.) pievieno apmēram 10 mg BHT (3.12.) un tur šķīdumu ledusskapī (ne ilgāk par četrām nedēļām);
7.5. BHT vietā var izmantot hidrohinonu;
7.6. Izmantojot normālās fāzes
kolonnu, var atdalīt 
tokoferolu;
7.7. Nātrija askorbāta šķīduma vietā var izmantot apmēram 150 mg askorbīnskābes;
7.8. Nātrija sulfīda šķīduma vietā var izmantot apmēram 50 mg EDTA.
8. Atkārtojamība
Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 15% no lielākā rezultāta.
9. Salīdzinošās testēšanas rezultāti 1
|
Premikss |
Premiksa barība |
Minerālvielu koncentrāts |
Olbaltumvielu barība |
Barība sivēniem |
|
|
L: |
12 |
12 |
12 |
12 |
12 |
|
n |
48 |
48 |
48 |
48 |
48 |
|
vidējais [mg/kg] |
17380 |
1187 |
926 |
315 |
61,3 |
|
sr [mg/kg] |
384 |
45,3 |
25,2 |
13,0 |
2,3 |
|
r [mg/kg] |
1075 |
126,8 |
70,6 |
36,4 |
6,4 |
|
CVr [%] |
2,2 |
3,8 |
2,7 |
4,1 |
3,8 |
|
sR [mg/kg] |
830 |
65,0 |
55,5 |
18,9 |
7,8 |
|
R [mg/kg] |
2324 |
182,0 |
155,4 |
52,9 |
21,8 |
|
CVR [%] |
4,8 |
5,5 |
6,0 |
6,0 |
12,7 |
|
L: laboratoriju skaits n: atsevišķu vērtību skaits sr: atkārtojamības standarta novirzes sR: reproducējamības standarta novirzes r: atkārtojamība R reproducējamība CVr: atkārtojamības variāciju koeficients CVR: reproducējamības variāciju koeficients |
|||||
1 Veikusi Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs– und Forschungsanstalten (VDLUFA) darba grupa.
Zemkopības ministrs M.Roze
46.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Triptofāna noteikšana
1. Mērķis un darbības joma
Ar šo metodi nosaka kopējo un brīvo triptofānu barībā. Metode neizšķir D un L formas.
2. Princips
2.1. Lai noteiktu kopējo triptofāna saturu, paraugu ar piesātinātu bārija hidroksīda šķīdumu hidrolizē sārmainā vidē un 20 stundas karsē 110°C temperatūrā. Pēc hidrolīzes pievieno iekšējo standartu.
2.2. Lai noteiktu brīvo triptofānu, paraugu iekšējā standarta klātbūtnē ekstrahē viegli skābā vidē.
2.3. Triptofānu un iekšējo standartu hidrolizātā vai ekstraktā nosaka, izmantojot AEŠH ar fluorescences detektoru.
3. Reaģenti
3.1. Divreiz destilēts ūdens vai līdzvērtīgas kvalitātes ūdens– vadītspēja < 10 μS /cm;
3.2. Standarta viela: triptofāns žāvēts vakuumā virs fosfora pentoksīda –tīrība/saturu ≥ 99%;
3.3. Iekšējā standarta substance: –metil–triptofāns žāvēts vakuumā virs fosfora pentoksīda– tīrība/saturs ≥ 99%
3.4. Bārija hidroksīda oktahidrāts (jārūpējas, lai Ba (OH)2 × 8 H2O ilgstoši nepakļautu gaisa iedarbībai, lai izvairītos no BaCO3 veidošanās, kas varētu traucēt noteikšanu) (skat. novērojumu 9.3.);
3.5. Nātrija hidroksīds;
3.6. Ortofosforskābe– w=85%;
3.7. Sālsskābe– ρ 20 = 1,19 g/ml
3.8. Metanols– AEŠH kvalitāte;
3.9. Petrolēteris– vārīšanās intervāls 40–60°C;
3.10. Nātrija hidroksīda šķīdums– c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5.) izšķīdina ūdenī un uzpilda līdz 1 l ar ūdeni (3.1.);
3.11. Sālsskābe– c=6 mol/l: ņem 492 ml HCl (3.7.) un uzpilda līdz 1l ar ūdeni;
3.12. Sālsskābe– c=1 mol/l: ņem 82 ml HCl (3.7) un uzpilda līdz 1l ar ūdeni;
3.13. Sālsskābe– c=0,1 mol/l: ņem 8,2 ml HCl (3.7) un uzpilda līdz 1l ar ūdeni;
3.14. Ortofosforskābe– c = 0,5 mol/l: ņem 34 ml ortofosforskābes (3.6) un uzpilda līdz 1l ar ūdeni (3.1.);
3.15. Koncentrēts triptofāna (3.2.) šķīdums– c = 2,50 μmol/ml: 500 ml mērkolbā izšķīdina 0,2553 g triptofāna (3.2.) un uzpilda līdz atzīmei ar sālsskābi (3.13). Glabā–18oC ne ilgāk kā četras nedēļas;
3.16. Koncentrēts iekšējā standarta šķīdums– c = 2,50 μmol/ml: 500 ml mērkolbā izšķīdina 0,2728 g α –metiltriptofāna (3.3.) un uzpilda līdz atzīmei ar sālsskābi (3.13). Glabā –18oC ne ilgāk kā četras nedēļas;
3.17. Triptofāna un iekšējā standarta kalibrēšanas šķīdumi: ņem 2,00 ml koncentrēta triptofāna (3.15.) šķīduma un 2,00 ml koncentrēta iekšējā standarta (–metil–triptofāna) šķīduma (3.16.). Atšķaida ar ūdeni (3.1.) un metanolu (3.8.) līdz aptuveni tam pašam tilpumam un metanola koncentrācijai (10–30%), kā iegūtajā hidrolizātā. Šķīdumu sagatavo tieši pirms lietošanas. Sagatavošanas laikā aizsargāt no tiešas saules gaismas;
3.18. Etiķskābe;
3.19. 1,1,1–trihlor–2–metil–2–propanols;
3.20. Etanolamīns >98%;
3.21. 1 g 1,1,1–trihlor–2–metil–2–propanola (3.19.) izšķīdināts 100 ml metanola (3.8.);
3.22. Kustīgā fāze AEŠH: 3,00 g etiķskābes (3.18.) pievieno 900 ml ūdens (3.1.) un 50,0 ml 1,1,1–trihlor–2–metil–2– propanola (3.19.) šķīduma (3.21.) metanolā (3.8.) (1g/ 100 ml). Koriģē pH līdz 5,00, izmantojot etanolamīnu (3.20.). Uzpilda ar ūdeni (3.1.) līdz 1000 ml.
4. Iekārtas
4.1. AEŠH iekārta ar spektrofluorometrijas detektoru;
4.2. Šķidruma hromatogrāfijas colonna– 125 mm x 4mm, C18, 3 μm pakojums vai līdzvērtīgs;
4.3. pH–metrs;
4.4. Polipropilēna 125 ml kolba ar platu kaklu un skrūvējamu vāciņu;
4.5. Membrānas filtrs– 0,45 μm;
4.6. Autoklāvs– 110 (± 2)°C, 1,4 (± 0,1) bar;
4.7. Mehāniskais kratītājs vai magnētiskais maisītājs;
4.8. Virpuļmaisītājs.
5. Darba gaita
5.1. Parauga sagatavošana
Paraugu samaļ tā, lai to var izsijāt caur 0,5 mm lielu acu sietu. Paraugus ar augstu mitruma saturu pirms malšanas žāvē gaisā, temperatūrā, kas nepārsniedz 50°C, vai sasaldējot. Paraugus ar augstu tauku saturu pirms malšanas ekstrahē ar petrolēteri (3.9.).
5.2. Brīvā triptofāna (ekstrakta) noteikšana
5.2.1. Piemērotu sagatavotā parauga (5.1.) apjomu (1–5 g) ar precizitāti līdz 1 mg nosver koniskā kolbā. Pievieno 100,0 ml sālsskābes– c= 0,1 mol/l (3.13.) un 5,00 ml koncentrēta iekšējā standarta šķīduma (3.16.). 60 minūtes krata vai maisa, izmantojot mehānisko kratītāju vai magnētisko maisītāju (4.7.). Ļauj izgulsnēties nogulsnēm un 10,0 ml centrifugāta ar pipeti pārnes uz vārglāzi. Pievieno 5 ml ortofosforskābes– c = 0,5 mol/l (3.14.). Izmantojot nātrija hidroksīdu– c = 1,0 mol/l (3.10.), koriģē pH līmeni līdz 3,0. Pievieno pietiekami daudz metanola (3.8.), lai metanola koncentrācija galīgajā tilpumā būtu starp 10 un 30%. Piemērotu tilpumu pārnes uz mērkolbu un atšķaida ar ūdeni līdz hromatogrāfijai nepieciešamajam tilpumam (apmēram tas pats tilpums kā kalibrēšanas standartšķīdumam (3.17.)).
5.2.2. Pirms ievadīšanas AEŠH kolonnā dažus ml šķīduma filtrē caur 0,45 μm membrānas filtru (4.5.). Turpina hromatogrāfiju tā, kā aprakstīts 5.4.apakšpunktā.
5.2.3. Standartšķīdumu un ekstraktus aizsargā no tiešas saules gaismas. Ja ekstraktus nav iespējams analizēt tajā pašā dienā, tos var glabāt 5°C temperatūrā ne ilgāk kā trīs dienas.
5.3. Kopējā triptofāna (hidrolizāta) noteikšana
5.3.1. Polipropilēna kolbā (4.4.) nosver 0,1 līdz 1 g sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 0,2 mg. Nosvērtajā parauga porcijā būtu jābūt apmēram 10 mg slāpekļa. Pievieno 8,4 g bārija hidroksīda oktahidrāta (3.4.) un 10 ml ūdens. Maisa virpuļmaisītājā (4.8.) vai magnētiskajā maisītājā (4.7.). Ar teflonu pārklātu magnētu atstāj maisījumā. Trauka sieniņas noskalo ar 4 ml ūdens. Kolbai uzliek skrūvējamo vāciņu un vaļīgi aiztaisa. Ieliek autoklāvā (4.6.) ar verdošu ūdeni un tvaicē 30–60 minūtes. Aizver autoklāvu un 20 stundas autoklavē 110±2°C temperatūrā.
5.3.2. Pirms autoklāva atvēršanas temperatūru samazina tieši zem 100°C. Lai novērstu Ba (OH)2 · 8 H2O kristalizēšanos, siltajam maisījumam pievieno 30 ml ūdens istabas temperatūrā. Viegli krata vai maisa. Pievieno 2,00 ml koncentrēta iekšējā standarta (– metil– triptofāna) šķīduma (3.16.). Trauku 15 minūtes atdzesē ūdens/ledus vannā.
5.3.3. Tad pievieno 5 ml ortofosforskābes– c = 0,5 mol/l (3.14.). Tur trauku dzesēšanas vannā, maisot neitralizē ar HCl– c=6 mol/l (3.11.), un koriģē pH līmeni līdz 3,0, pievienojot HCl– c= 1 mol/l (3.12). Pievieno pietiekami daudz metanola, lai galīgajā tilpumā metanola koncentrācija būtu starp 10% un 30%. Pārnes uz piemērota tilpuma mērkolbu un atšķaida ar ūdeni līdz definētajam tilpumam, kas nepieciešams hromatogrāfijai (piemēram, 100 ml). Metanola pievienošana nedrīkst izraisīt izgulsnēšanos.
5.3.4. Dažus ml šķīduma pirms ievadīšanas AEŠH kolonnā filtrē caur 0,45 µm membrānas filtru (4.5.). Turpina hromatogrāfiju tā, kā aprakstīts 5.4.apakšpunktā.
5.3.5. Standartšķīdumu un hidrolizātus sargā no tiešas saules gaismas iedarbības. Ja hidrolizātus nav iespējams analizēt tajā pašā dienā, tos var uzglabāt 5°C temperatūrā ne vairāk kā trīs dienas.
5.4. AEŠH noteikšana
Izokrātiskai izskalošanai piedāvā šādus parametrus:
|
Šķidruma hromatogrāfijas kolonna (4.2.): |
125 mm x 4 mm, C18, 3 μm pakojuma, vai līdzvērtīga |
|
Kolonnas temperatūra: |
Istabas temperatūra |
|
Kustīgā fāze (3.2.2.): |
3,00 g etiķskābes (3.18.) + 900 ml ūdens (3.1.)+ 50,0 ml 1,1,1,–trihlor–2–metil–2–propanola (3.19.) šķīduma (3.21) metanolā (3.8.) (1 g/mol). Izmantojot etanolamīnu (3.20.), koriģē pH līdz 5,00. Uzpilda ar ūdeni (3.1.) līdz 1000 ml. |
|
Plūsmas ātrums: |
1 ml/min. |
|
Kopējais hromatografēšanas laiks: |
Apmēram 34 min. |
|
Viļņu garums noteikšanai: |
Ierosināšana: 280 nm, emisija: 356 nm |
|
Ievadāmais tilpums: |
20 μl |
Var izmantot citus parametrus, ja tie dod līdzvērtīgus rezultātus (skat. arī novērojumus 9.1. un 9.2.).
6. Rezultātu aprēķināšana
(A x B x C x D x E x MW) / (F x G x H x 10000 W) = g triptofāna uz 100 g parauga
A = iekšējā standarta smailes laukums, kalibrēšanas standartšķīdums (3.17.)
B = triptofāna smailes laukums, ekstrakts (5.2.) vai hidrolizāts (5.3.)
C = koncentrēta triptofāna šķīduma (3.15.) tilpums, ko pievieno kalibrēšanas šķīdumam (3.17.) ml (2 ml)
D = koncentrēta triptofāna šķīduma (3.15.) koncentrācija, ko pievieno kalibrēšanas šķīdumam (3.17.) μmol/ml (2,50)
E = koncentrēta iekšējā standarta šķīduma (3.16.) tilpums, kas pievienots ekstraktam (5.2.) (5,00 ml) vai hidrolizātam (5.3.) (2,00 ml)
F= iekšējā standarta smailes laukums, ekstrakta (5.2.) vai hidrolizāta (5.3.)
G = triptofāna smailes laukums, kalibrēšanas standartšķīduma (3.17.)
H = koncentrēta iekšējā standarta šķīduma (3.16.) tilpums, ko pievieno kalibrēšanas standartšķīdumam (3.17.) ml (2,00 ml)
W = parauga masa (koriģēta atbilstoši sākotnējai masai, ja paraugs ir žāvēts un/vai attaukots) g
MW = triptofāna molekulmasa (204,23)
7. Atkārtojamība
Atšķirība starp viena un tā paša parauga divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10% no lielākā rezultāta.
8. Salīdzinošās testēšanas rezultāti
8.1. Kopienas salīdzinošajā testēšanā (ceturtais salīdzinājums) analizēja trīs paraugus 12 laboratorijās, lai sertificētu hidrolīzes metodi. Katru paraugu analizēja piecas reizes. Rezultāti ir attēloti šajā tabulā:
|
1. paraugs Cūku barība |
2. paraugs Ar L–triptofānu papildināta cūku barība |
3. paraugs Barības koncentrāts cūkām |
|
|
L: |
12 |
12 |
12 |
|
N |
50 |
55 |
50 |
|
vidējais [g/kg] |
2,42 |
3,40 |
4,22 |
|
sr [g/kg] |
0,05 |
0,05 |
0,08 |
|
r [g/kg] |
0,14 |
0,14 |
0,22 |
|
CVr [%] |
1,9 |
1,6 |
1,9 |
|
sR [g/kg] |
0,15 |
0,20 |
0,09 |
|
R [g/kg] |
0,42 |
0,56 |
0,25 |
|
CVR [%] |
6,3 |
6,0 |
2,2 |
|
L: To laboratoriju skaits, kas iesniedz rezultātus n: atsevišķu rezultātu skaits, izņemot galējos rezultātus (identificē ar Koksrana, Diksona galējo rezultātu testu) sr: atkārtojamības standartnovirze sR: reproducējamības standartnovirze r: atkārtojamība R reproducējamība CVr atkārtojamības variāciju koeficients, % CVR: reproducējamības variāciju koeficients,% |
|||
8.2. Vēl vienā Kopienas salīdzinošajā testēšanā (trešais salīdzinājums) analizēja divus paraugus 13 laboratorijās, lai sertificētu brīvā triptofāna ekstrakcijas metodi. Katru paraugu analizēja piecas reizes. Rezultāti ir attēloti šajā tabulā:
|
4. paraugs Kviešu un sojas maisījums |
5. paraugs Ar triptofānu (0,457 g/kg) papildināts kviešu un sojas maisījums (4. paraugs) |
|
|
L: |
12 |
12 |
|
n |
55 |
60 |
|
vidējais [g/kg] |
0,391 |
0,931 |
|
sr [g/kg] |
0,005 |
0,012 |
|
r [g/kg] |
0,014 |
0,034 |
|
CVr [%] |
1,34 |
1,34 |
|
sR [g/kg] |
0,018 |
0,048 |
|
R [g/kg] |
0,050 |
0,134 |
|
CVR [%] |
4,71 |
5,11 |
|
L: To laboratoriju skaits, kuras iesniedz rezultātus n: atsevišķu rezultātu skaits, izņemot galējos rezultātus (identificē ar Koksrana, Diksona galējo rezultātu testu) sr: atkārtojamības standartnovirze sR: reproducējamības standartnovirze r: atkārtojamība R reproducējamība CVr: atkārtojamības variāciju koeficients,% CVR: reproducējamības variāciju koeficients,% |
||
8.3. Tika organizēta cita Kopienas salīdzinošā testēšana, kurā septiņās laboratorijās analizēja četrus paraugus ar mērķi sertificēt triptofānu hidrolīzi. Katru paraugu analizēja piecas reizes. Rezultāti ir attēloti šajā tabulā:
|
1. paraugs Jaukta cūku barība (CRM 117) |
2. paraugs Zivju milti ar zemu tauku saturu (CRM 118) |
3. paraugs Sojas pupu milti (CRM 119) |
4. paraugs Sausais vājpiens (CRM 120) |
|
|
L: |
7 |
7 |
7 |
7 |
|
n |
25 |
30 |
30 |
30 |
|
vidējais [g/kg] |
2,064 |
8,801 |
6,882 |
5,236 |
|
sr [g/kg] |
0,021 |
0,101 |
0,089 |
0,040 |
|
r [g/kg] |
0,059 |
0,283 |
0,249 |
0,112 |
|
CVr [%] |
1,04 |
1,15 |
1,30 |
0,76 |
|
sR [g/kg] |
0,031 |
0,413 |
0,283 |
0,221 |
|
R [g/kg] |
0,087 |
1,156 |
0,792 |
0,619 |
|
CVR [%] |
1,48 |
4,69 |
4,11 |
4,22 |
|
L: To laboratoriju skaits, kuras iesniedz rezultātus n: atsevišķu rezultātu skaits, izņemot galējos rezultātus (identificē ar Koksrana, Diksona galējo rezultātu testu) sr: atkārtojamības standartnovirze sR: reproducējamības standartnovirze r: atkārtojamība R reproducējamība CVr: atkārtojamības variāciju koeficients, % CVR: reproducējamības variāciju koeficients, % |
||||
9. Novērojumi
9.1. Šādi īpaši hromatogrāfiskie parametri var nodrošināt labāku triptofāna atdalīšanos no –metil–triptofāna
Izokrātiskā izskalošana, kam seko gradienta kolonnas tīrīšana:
|
Šķidruma hromatogrāfijas kolonna: |
125 mm x 4 mm, C18, 5 μm pakojums vai līdzvērtīgs |
||
|
Kolonnas temperatūra: |
32 °C |
||
|
Kustīgā fāze: |
A: 0,01 mol/l KH2PO4/Metanols, 95 + 5 (V + V) B Metanols |
||
|
Gradienta programma: |
0 min |
100 % A |
0 % B |
|
15 min |
100 % A |
0 % B |
|
|
17 min |
60 % A |
40 % B |
|
|
19 min |
60 % A |
40 % B |
|
|
21 min |
100 % A |
0 % B |
|
|
33 min |
100 % A |
0 % B |
|
|
Plūsmas ātrums |
1,2 ml/min |
||
|
Kopējais hromatografēšanas ilgums: |
Apmēram 33 min. |
||
9.2. Hromatogrāfijas rezultāti atšķiras atkarībā no AEŠH tipa un izmantotā kolonnas pakojuma materiāla. Izvēlētajai sistēmai jānodrošina triptofāna un iekšējā standarta bāzes līnijas atdalīšanās. Turklāt ir ļoti svarīgi degradācijas produktus atdalīt no triptofāna un iekšējā standarta. Lai pārbaudītu, vai zem iekšējā standarta smailes nav piemaisījumu, hidrolizātiem hromatogramma jāuzņem bez iekšējā standarta. Hromatografēšanas ilgumam ir jābūt pietiekamam, lai izskalotu visus degradēšanas produktus, citādi neizskaloto produktu vēlie pīķi var traucēt turpmākās hromatogrammas
Izmantojamajā diapazonā hromatogrāfiskajai sistēmai jāuzrāda lineārs signāls. Signāla linearitāte jāmēra nemainīgā (normālā) iekšējā standarta koncentrācijā un mainīgās triptofāna koncentrācijās. Gan triptofāna, gan iekšējā standarta pīķiem ir jābūt AEŠH/fluorescences sistēmas lineārajā intervālā. Ja triptofāna un/vai iekšējā standarta pīķis (pīķi) ir pārāk mazs (i) vai liels (i), analīze jāatkārto ar citu parauga apjomu un/vai citu galīgo tilpumu.
9.3. Bārija hidroksīds
Laika gaitā bārija hidroksīda šķīdība samazinās. Tas padara AEŠH šķīdumu nedzidru un var uzrādīt zemu triptofāna saturu.
Zemkopības ministrs M.Roze
47.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Dioksīnu (PCDD/PCDF) noteikšana
Paraugu noņemšanas metodes dioksīnu (PCDD/PCDF) noteikšanai un dioksīniem līdzīgu PCB kvantitatīvai noteikšanai atsevišķu veidu barībā
1. Mērķis un darbības sfēra
Paraugus, kas paredzēti dioksīnu (PCDD/PCDF) satura oficiālajai kontrolei un dioksīniem līdzīgu PCB1 satura noteikšanai barībā, ņem saskaņā ar noteikumiem, kuri aprakstīti Komisijas 1976. gada 1. marta Direktīvā 76/371/EEK, ar ko nosaka Kopienas paraugu ņemšanas metodes barības oficiālai kontrolei. Tā iegūtos kopparaugus uzskata par raksturīgiem tām partijām vai apakšpartijām, no kurām tie ņemti. Atbilstību maksimāli pieļaujamajai koncentrācijai, kas noteikta Direktīvā 1999/29/EK, konstatē, pamatojoties uz laboratorijas paraugos noteikto koncentrāciju.
2. Partijas vai apakšpartijas atbilstība specifikācijai
Ja kontroles laboratorijā pirmajā analīzē iegūtais rezultāts ir līdz 20% mazāks vai lielāks nekā maksimāli pieļaujamā koncentrācija, tad laboratorijas paraugu apstiprinājumam analizē atkārtoti un aprēķina vidējo rezultātu. Partiju pieņem, ja pirmās analīzes rezultāts ir vairāk nekā par 20% mazāks nekā maksimāli pieļaujamā koncentrācija, vai — gadījumos, kad vajadzīga atkārtota analīze — rezultātu vidējā vērtība atbilst attiecīgajai maksimāli pieļaujamajai koncentrācijai, kura noteikta Direktīvā 1999/29/EC.
|
Radniecīgā viela |
TEF vērtība |
Radniecīgā viela |
TEF vērtība |
|
Dibenzo–p–dioksīni (PCDD) |
“Dioksīniem līdzīgi” PCB: neorto PCB + mono–orto PCB |
||
|
2,3,7,8–TCDD |
1 |
Neorto PCB |
|
|
1,2,3,7,8–PeCDD |
1 |
PCB 77 |
0,0001 |
|
1,2,3,4,7,8–HxCDD |
0,1 |
PCB 81 |
0,0001 |
|
1,2,3,6,7,8–HxCDD |
0,1 |
PCB 126 |
0,1 |
|
1,2,3,7,8,9–HxCDD |
0,1 |
PCB 169 |
0,01 |
|
1,2,3,4,6,7,8–HpCDD |
0,01 |
||
|
OCDD |
0,0001 |
||
|
Dibenzofurāni (PCDF) |
Mono-orto-PCB |
||
|
2,3,7,8–TCDF |
0,1 |
PCB 105 |
0,0001 |
|
1,2,3,7,8–PeCDF |
0,05 |
PCB 114 |
0,0005 |
|
2,3,4,7,8–PeCDF |
0,5 |
PCB 118 |
0,0001 |
|
1,2,3,4,7,8–HxCDF |
0,1 |
PCB 123 |
0,0001 |
|
1,2,3,6,7,8–HxCDF |
0,1 |
PCB 156 |
0,0005 |
|
1,2,3,7,8,9–HxCDF |
0,1 |
PCB 157 |
0,0005 |
|
2,3,4,6,7,8–HxCDF |
0,1 |
PCB 167 |
0,00001 |
|
1,2,3,4,6,7,8–HpCDF |
0,01 |
PCB 189 |
0,0001 |
|
1,2,3,4,7,8,9–HpCDF |
0,01 |
||
|
OCDF |
0,0001 |
||
|
Lietotie saīsinājumi: T— tetra, Pe— penta, Hx — heksa, Hp— hepta, O— okta, CDD– hlordibenzo–p–dioksīns, CDF— hlordibenzofurāns, CB– hlorbifenils. |
|||
1 PVO TEF tabula, kurā novērtēts risks cilvēkam, pamatojoties uz 1997. gada 15. līdz 18. jūnijā Stokholmā, Zviedrijā, notikušās Pasaules veselības organizācijas sanāksmē Zviedrijā, Stokholmā, secinājumiem (Van den Berg et al., (1998) Toxic Equivalency Factors (TEFs) for PCBs, PCDDs, PCDFs for Humans and for Wildlife. Environmental Health Perspectives, 106(12), 775).
2 OJ L 102, 15.4.1976, p. 1.
Paraugu sagatavošana un prasības, kas attiecas uz analīzes metodēm, kuras izmanto dioksīnu (PCDD/PCDF) koncentrācijas oficiālā kontrolē un dioksīniem līdzīgu PCB kvantitatīvā noteikšanā atsevišķu veidu barībā
1. Mērķis un darbības sfēra
1.1. Šīs prasības jāpiemēro, ja barības līdzekļus un barību analizē, lai kvantitatīvi noteiktu dioksīnus (polihlordibenzo–p–dioksīnus (PCDD) un polihlordibenzofurānus (PCDF)) un dioksīniem līdzīgus polihlorbifenilus (PCB).
1.2. Dioksīnu klātbūtnes uzraudzību barībā var veikt saskaņā ar stratēģiju, kas paredz izmantot skrīninga metodi, ar kuru atlasa paraugus, kur dioksīnu un dioksīniem līdzīgu PCB koncentrācija ir par 30%līdz 40% mazāka vai lielāka, nekā vajadzīgā koncentrācija. Paraugos, kuros dioksīnu koncentrācija ir ievērojama, tā jānoteic/jāapstiprina ar apstiprinājuma metodi.
1.3. Skrīninga metodes ir metodes, ko izmanto dioksīnu un dioksīniem līdzīgus PCB kvalitatīvai noteikšanai ar noteiktu ticamību. Šīs metodes ir jaudīgas, un tās izmanto potenciāli pozitīvu paraugu atlasīšanai. Tās ir īpaši izstrādātas, lai nevarētu iegūt šķietami negatīvus rezultātus.
1.4. Apstiprinājuma metodes ir metodes, ar ko iegūst pilnīgu vai papildu informāciju, pēc kuras dioksīnus un dioksīniem līdzīgus PCB ar noteiktu ticamību var precīzi noteikt kvalitatīvi un kvantitatīvi.
2. Papildu informācija
2.1. Tā kā vides un bioloģiskajos paraugos (to skaitā barības līdzekļu/barības paraugos) parasti ir dažādu dioksīniem radniecīgu vielu sarežģīti maisījumi, lai atvieglotu riska novērtēšanu, ir radīts toksiskuma ekvivalences koeficientu (TEF) jēdziens. Ar TEF izsaka 2,3,7,8–aizvietoto PCDD un PCDF maisījumu koncentrāciju un pēdējā laikā dažu to dioksīniem līdzīgu neorto– un mono–orto– hloraizvietoto PCB koncentrāciju, kuriem ir dioksīniem līdzīga aktivitāte 2,3,7,8–TCDD toksiskuma ekvivalentos (TEQ) (skatīt 1. zemsvītras piezīmi I pielikumā).
2.2. Atsevišķo vielu koncentrācijas paraugā reizina ar attiecīgo TEF un pēc tam summē, lai iegūtu kopējo dioksīniem līdzīgo savienojumu koncentrāciju, ko izsaka ar TEQ.
2.3. Lai aprēķinātu “augšējo robežu”, par katras kvantitatīvi nenoteiktās radniecīgās vielas daļu TEQ jāizmanto kvantitatīvās noteikšanas robeža.
2.4. Lai aprēķinātu “apakšējo robežu”, par katras kvantitatīvi nenoteiktās radniecīgās vielas daļu TEQ jāizmanto nulle.
2.5. Lai aprēķinātu “vidējo robežu”, par katras kvantitatīvi nenoteiktās radniecīgās vielas daļu TEQ jāizmanto puse noteikšanas robežas.
3. Kvalitātes nodrošināšanas prasības, kas ievērojamas, sagatavojot paraugus
3.1. Piemēro vispārīgos noteikumus par paraugu sagatavošanu analīzei, kas izklāstīti pielikumā Komisijas 1981. gada 30. jūlija Direktīvai 81/680/EEK, ar ko groza Direktīvu 71/250/EEK, Direktīvu 71/393/EEK, Direktīvu 72/199/EEK, Direktīvu 73/46/EEK, Direktīvu 74/203/EEK, Direktīvu 75/84/EEK, Direktīvu 76/372/EEK un Direktīvu 78/633/EEK, ar kurām nosaka Kopienas analīzes metodes barības oficiālai kontrolei1.
3.2. Turklāt jāizpilda šādas prasības:
– paraugi jāglabā un jātransportē stikla, alumīnija, polipropilēna vai polietilēna traukos. No parauga trauka jānotīra papīra putekļu zīmes. Stikla trauki jāskalo ar šķīdinātājiem, kuros iepriekš pārbaudīta dioksīnu klātbūtne;
– jāizdara tukšā analīze, izpildot visu analīzes procedūru bez parauga;
– ekstrakcijai izmantojamā parauga masai jābūt pietiekamai, lai tas atbilstu prasībām, kuras attiecas uz jutību.
4. Prasības laboratorijām
4.1. Laboratorijas pierāda metodes efektivitāti vajadzīgās koncentrācijas diapazonā, kas ir, piemēram, 0,5 ×, 1 × un 2 × vajadzīgā koncentrācija, un ka šajā diapazonā ir pieņemams atkārtotu analīžu variāciju koeficients. Sīki izstrādātus piemērotības kritērijus skatīt 5. punktā;
4.2. Apstiprinājuma metodes kvantitatīvās noteikšanas robeža ir aptuveni viena piektdaļa no nosakāmās koncentrācijas vērtības, lai nodrošinātu, ka vajadzīgā līmeņa diapazonā ir pieņemami variāciju koeficienti;
4.3. Kvalitātes iekšējās kontroles nolūkos regulāri izdara tukšo paraugu analīzes un kontrolparaugu analīzes ar standartpiedevu metodi vai kontrolparaugu analīzes (ja iespējams, ieteicams izmantot sertificētu standartmateriālu);
4.4. Sekmīga piedalīšanās starplaboratoriju testēšanā, kurā novērtē laboratorijas kompetenci, vislabāk liecina par spēju izdarīt specifiskas analīzes. Tomēr sekmīga piedalīšanās starplaboratoriju testēšanā, kurā analizē, piemēram, augsnes, grunts vai notekūdeņu paraugus, ne vienmēr apliecina kompetenci arī pārtikas un barības paraugu jomā, jo tajos ir zemāks piesārņojuma līmenis. Tāpēc obligāti ir pastāvīgi jāpiedalās starplaboratoriju testēšanā, kurā kvantitatīvi noteic dioksīnus un dioksīniem līdzīgus PCB attiecīgajās barības/pārtikas matricās.
4.5. Laboratorijas akreditē atzīta organizācija, kas darbojas saskaņā ar ISO Guide 58, lai nodrošinātu to, ka laboratorijās piemēro analīžu kvalitātes nodrošināšanu. Laboratorijas jāakreditē, ievērojot ISO/IEC/17025:1999 standartu.
5. Prasības, kas ievērojamas, veicot analīzes procedūras dioksīnu un dioksīniem līdzīgu PCB noteikšanai
5.1. Analīzes procedūru piemērotības pamatprasības:
5.1.1. Liela jutība un zemas noteikšanas robežas. PCDD un PCDF mazākajam noteicamajam daudzumam jābūt TEQ pikogramos (10–12 g), jo daži šie savienojumi ir ārkārtīgi toksiski. Ir zināms, ka PCB koncentrācija ir augstāka par PCDD un PCDF koncentrāciju. Attiecībā uz lielāko daļu PCB radniecīgo vielu pietiekama jutība ir nanogramos (10–9 g). Tomēr, lai kvantitatīvi noteiktu toksiskākās dioksīniem līdzīgo PCB radniecīgās vielas (jo īpaši orto– neaizvietotās radniecīgās vielas), vajadzīga tāda pati jutība kā PCDD un PCDF noteikšanai.
5.1.2. Augsta selektivitāte (specifiskums). PCDD, PCDF un dioksīniem līdzīgie PCB jāatšķir no daudziem citiem vienlaikus ekstrahētiem un iespējami traucējošiem savienojumiem, kuru koncentrācija līdz vairākām kārtām pārsniedz noteicamās vielas koncentrāciju. Ja izmanto gāzu hromatogrāfijas/masspektrometrijas (GC/MS) metodes, jādiferencē tādas atšķirīgas radniecīgas vielas kā toksiskās (piemēram, septiņpadsmit 2,3,7,8–aizvietotie PCDD un PCDF un dioksīniem līdzīgie PCB) un citas radniecīgas vielas. Izmantojot biotestus, jāspēj selektīvi noteikt TEQ vērtības, ko izsaka ar PCDD, PCDF un dioksīniem līdzīgo PCB summu.
5.1.3. Liela precizitāte (pareizība un precizitāte). Kvantitatīvajā noteikšanā jāiegūst pareizs patiesās koncentrācijas novērtējums paraugā. Liela precizitāte (mērījuma precizitāte: mērāmā lieluma izmērītās vērtības un tā patiesās vai pieņemtās vērtības sakritība) ir vajadzīga, lai noteiktās TEQ mazās ticamības dēļ nevarētu noraidīt parauga analīzes rezultātus. Precizitāti izsaka ar pareizību (starpību starp analizējamās vielas vidējo vērtību, kas izmērīta, analizējot sertificētu standartmateriālu, un tās sertificēto vērtību, kuru izsaka procentos no sertificētās vērtības) un precizitāti (precizitāti parasti aprēķina, izsakot ar standartnovirzi, tostarp atkārtojamības un reproducējamības standartnovirzi, un tā rāda, cik precīzi sakrīt rezultāti, ko eksperimentāli iegūst, noteiktos apstākļos vairākkārt atkārtojot analīzes procedūru).
5.1.4. Par skrīninga metodēm var izmantot gan biotestus, gan GC/MS metodes; par apstiprinošajām metodēm izmanto augstas izšķirtspējas gāzu hromatogrāfijas/augstas izšķirtspējas masspektrometrijas (HRGC/HRMS) metodes. Kopējās TEQ vērtībai jāatbilst šādiem kritērijiem:
|
Skrīninga metodes |
Apstiprinājuma metodes |
|
|
Šķietami negatīvi rezultāti |
<1% |
|
|
Ticamība |
No –20% līdz +20% |
|
|
Variāciju koeficients |
<30% |
<15% |
6. Īpašas prasības, kas attiecas uz GC/MS metodēm, kuras izmanto skrīningam vai apstiprināšanai
6.1. Lai analīzes procedūra būtu derīga, pašā analīzes sākumā, piemēram, pirms ekstrakcijas, jāpievieno ar 13C iezīmēti 2,3,7,8–hloraizvietoti iekšējie PCDD/F standarti (un, ja kvantitatīvi jānoteic dioksīniem līdzīgi PCB, tad ar 13C iezīmēti dioksīniem līdzīgu PCB iekšējie standarti). Katrai tetra– līdz oktahloratvasināto PCDD/F homologu grupai jāpievieno vismaz viena radniecīga viela (un, ja kvantitatīvi jānoteic dioksīniem līdzīgi PCB, tad vismaz viena radniecīga viela katrai dioksīniem līdzīgu PCB homologu grupai) (alternatīvi jāpievieno vismaz viena radniecīga viela uz katru masspektrometrijai izraudzīto reģistrējamo jonu funkciju, ko izmanto PDDD/F un dioksīniem līdzīgu PCB uzraudzībai). Piemērojot apstiprinājuma metodes, priekšroka noteikti dodama visu septiņpadsmit ar 13C iezīmēto 2,3,7,8–aizvietoto iekšējo PCDD/F standartu lietojumam un visu divpadsmit ar 13C iezīmēto dioksīniem līdzīgo PCB iekšējo standartu lietojumam (ja kvantitatīvi jānoteic dioksīniem līdzīgi PCB).
6.2. Izmantojot attiecīgus kalibrēšanas šķīdumus, signāla relatīvā attiecība pret masas vienību jānoteic arī tām radniecīgajām vielām, kurām nepievieno ar 13C iezīmētu analogu.
6.3. Pirms ekstrakcijas iekšējie standarti obligāti jāpievieno augu izcelsmes barībai un dzīvnieku izcelsmes barībai, kas satur mazāk nekā 10% tauku. Dzīvnieku izcelsmes barībai, kas satur vairāk nekā 10% tauku, iekšējos standartus var pievienot vai nu pirms ekstrakcijas, vai pēc tauku ekstrakcijas. Ekstrakcijas efektivitāte jāizvērtē atkarībā no tā, kurā analīzes posmā ievada iekšējos standartus, un no tā, vai rezultātus izsaka produktam vai taukiem.
6.4. Pirms GC/MS analīzes jāpievieno viens vai divi atgūstamības (surogāta) standarti.
6.5. Atgūstamība jākontrolē. Attiecībā uz apstiprinājuma metodēm atsevišķo iekšējo standartu atgūstamībai jābūt diapazonā no 60% līdz 120%. Lielāka vai mazāka atsevišķu radniecīgo vielu, jo īpaši dažu hepta- un oktahloratvasināto dibenzodioksīnu un dibenzofurānu atgūstamība ir pieņemama ar nosacījumu, ka to daļa TEQ vērtībā nepārsniedz 10% no kopējās TEQ vērtības (to nosaka tikai pēc PCDD/F). Ja piemēro skrīninga metodes, atgūstamībai jābūt diapazonā no 30% līdz 140%.
6.6. Dioksīni no tādiem traucējošiem hloratvasinātiem savienojumiem kā PCB un hloratvasinātiem difenilēteriem jāatdala ar piemērotām hromatogrāfijas metodēm (ieteicams ar florisila, alumīnija oksīda un/vai aktīvās ogles kolonnu).
6.7. Izomēru atdalīšanai gāzu hromatogrāfijā jābūt pietiekamai (1,2,3,4,7,8–HxCDF signāla attiecība pret 1,2,3,6,7,8–HxCDF signālu < 25 %).
6.8. Kvantitatīvā noteikšana jāveic saskaņā ar EPA 1613. metodes B pārskatīto redakciju— tetra– līdz oktahloratvasinātie dioksīni un furāni pēc atšķaidīšanas HRGC/HRMS— vai saskaņā ar citu metodi, kurai ir līdzvērtīgi efektivitātes kritēriji.
6.9. Starpība starp augšējo robežu un apakšējo robežu nedrīkst pārsniegt 20% attiecībā uz barību, kurā piesārņojums ar dioksīniem ir vienāds ar maksimāli pieļaujamo koncentrāciju vai pārsniedz to. Barībā, kurā piesārņojuma līmenis ir ievērojami zemāks par maksimāli pieļaujamo, starpība drīkst būt diapazonā no 25% līdz 40%.
7. Skrīninga analīzes metodes
7.1. Ievads
7.1.1. Skrīninga metodi var izmantot dažādām analītiskām pieejām: tikai skrīningam un kvantitatīvai noteikšanai.
Skrīnings
7.1.2. Parauga signālu salīdzina ar standartparauga signālu vajadzīgajā koncentrācijā. Paraugus, kuru signāls ir zemāks par standarta signālu, uzskata par negatīviem, bet tos, kuru signāls pārsniedz standarta signālu, par iespējami pozitīviem. Prasības:
7.1.2.1. katrā analīžu sērijā jāiekļauj tukšais(-ie) paraugs(-i) un standartparaugs(–i), ko ekstrahē un analizē vienlaicīgi identos apstākļos. Standartparauga signālam ievērojami jāpārsniedz tukšā parauga signāls;
7.1.2.2. jāiekļauj papildu standartparaugi, kuros attiecīgā koncentrācija ir 0,5 × un 2 × lielāka par vajadzīgo koncentrāciju, lai pierādītu analīzes efektivitāti vajadzīgajā diapazonā ar nolūku kontrolēt vajadzīgo koncentrāciju;
7.1.2.3. analizējot citas matricas, jāpierāda standartparauga(–u) piemērotība, vēlams, iekļaujot paraugus, kuros ar HRGC/HRMS noteiktā TEQ ir aptuveni tāda pati kā standartparaugā vai tukšajā paraugā, kam pievienots standarts, kurā ir šāda koncentrācija;
7.1.2.4. tā kā biotestos nevar izmantot iekšējos standartus, lai noteiktu vienas analīžu sērijas rezultātu standartnovirzi, ļoti liela nozīme ir atkārtojamības pārbaudēm. Variāciju koeficients nedrīkst pārsniegt 30%;
7.1.2.5. attiecībā uz biotestiem jādefinē noteicamie savienojumi, iespējamie traucējumi un maksimāli pieļaujamā koncentrācija tukšajā paraugā.
Kvantitatīvā noteikšana
Kvantitatīvai noteikšanai vajadzīga standartatšķaidījumu rinda, divkārša vai trīskārša attīrīšana un mērīšana, kā arī tukšā parauga un atgūstamības kontrole. Rezultātu var izteikt ar TEQ, pieņemot, ka savienojumi, kas dod signālu, atbilst TEQ principam. To var izpildīt, izmantojot TCDD (vai dioksīnu/furānu standartmaisījumu), lai uzzīmētu kalibrēšanas līkni, pēc kuras aprēķina TEQ līmeni ekstraktā un tātad paraugā. Pēc tam to koriģē atbilstīgi TEQ līmenim, ko aprēķina tukšajam paraugam (ņemot vērā lietoto šķīdinātāju un ķimikāliju piemaisījumus), un atgūstamībai (ko aprēķina pēc TEQ līmeņa kvalitātes kontroles paraugā, kurā ir aptuveni vajadzīgā koncentrācija). Svarīgi norādīt, ka daļu atgūstamības acīmredzamo zudumu var rasties matricas ietekmē un/vai starpības dēļ starp TEF vērtībām biotestos un oficiālajām TEF vērtībām, ko noteikusi PVO.
7.2. Prasības, kas attiecas uz skrīninga analīzes metodēm
7.2.1. Skrīningam var izmantot GC/MS analīzes metodes un biotestus. Attiecībā uz GC/MS metodēm jāievēro prasības, kas noteiktas 6. punktā. Šūnu biotestiem īpašas prasības noteiktas 7.3. punktā un komplektu biotestiem — 7.4. punktā;
7.2.2. Vajadzīga informācija par šķietami pozitīvu un šķietami negatīvu rezultātu skaitu no liela paraugu daudzuma, kurā ir paraugi, kuros noteicamā koncentrācija ir zem un virs maksimāli pieļaujamās koncentrācijas vai iedarbības koncentrācijas salīdzinājumā ar TEQ saturu, ko kvantitatīvi noteic ar apstiprinājuma analīzes metodi. Faktisko šķietami negatīvo rezultātu jābūt mazāk par 1%. Šķietami pozitīvo rezultātu skaitam jābūt pietiekami mazam, lai būtu lietderīgi izmantot skrīningu;
7.2.3. Pozitīvie rezultāti vienmēr jāapstiprina ar kādu apstiprinājuma analīzes metodi (HRGC/HRMS). Turklāt plaša TEQ diapazona paraugi jāapstiprina ar HRGC/HRMS (aptuveni 2% līdz 10% negatīvo paraugu). Informācijai par biotestu un HRGC/HRMS rezultātu atbilstību jābūt pieejamai;
7.3. Īpašas prasības, kas attiecas uz šūnu biotestiem
7.3.1. Ja veic biotestus, katrā analīzes kārtā jāizmanto TCDD vai dioksīnu/furānu maisījumu standarta koncentrāciju rinda (pilnas devas — signāla līkne ar R2> 0,95). Tomēr, analizējot paraugus ar mazu koncentrāciju, skrīningam var izmantot izvērstu līkni nelielu koncentrāciju apgabalam.
7.3.2. TCDD standartkoncentrācija (aptuveni trīskārša kvantitatīvās noteikšanas robeža) kvalitātes kontroles lapā jāizmanto par biotesta rezultātu konstantā periodā. Alternatīva varētu būt standartparauga relatīvais signāls salīdzinājumā ar TCDD kalibrēšanas līkni, jo šūnu signāls var būt atkarīgs no daudziem faktoriem.
7.3.3. Jāizveido un jāpārbauda katra veida standartmateriālu kvalitātes kontroles grafiki, lai pārliecinātos, ka rezultāts atbilst izvirzītajām pamatnostādnēm.
7.3.4. Jo īpaši attiecībā uz kvantitatīvajiem aprēķiniem izmantotā parauga atšķaidījuma inducētajam signālam jābūt signāla līknes lineārajā daļā. Paraugi, kuru signāls ir virs signāla līknes lineārās daļas, jāatšķaida un jāanalizē atkārtoti. Tāpēc ieteicams vienā reizē analizēt vismaz trīs atšķaidījumus vai vairāk.
7.3.5. Katram parauga atšķaidījumam, ja to analizē trijos atkārtojumos, rezultāta procentuālā standartnovirze nedrīkst pārsniegt 15%, un, ja to analizē trijās neatkarīgās analīzēs — 30%.
7.3.6. Var paredzēt, ka noteikšanas robeža ir šķīdinātāja tukšā parauga vai fona signāla trīskārša standartnovirze. Cita pieeja ir izmantot signālu, kas pārsniedz fona līmeni (indukcijas koeficients pieci × tukšā parauga signāls), ko aprēķina pēc dienas kalibrēšanas līknes. Var paredzēt, ka kvantitatīvās noteikšanas robeža ir šķīdinātāja tukšā parauga vai fona signāla pieckārša vai seškārša standartnovirze, vai izmantot signālu, kas nepārprotami pārsniedz fona līmeni (indukcijas koeficients 10 × šķīdinātāja tukšā parauga signāls), ko aprēķina pēc dienas kalibrēšanas līknes.
7.4. Īpašas prasības, kas attiecas uz biotestiem, kuros izmanto komplektus2
7.4.1. Jāievēro izgatavotāja norādījumi par paraugu sagatavošanu un analīzēm.
7.4.2. Testu komplektus nedrīkst izmantot pēc derīguma termiņa beigām.
7.4.3. Nedrīkst izmantot materiālus vai sastāvdaļas, ko paredzēts izmantot citos komplektos.
7.4.4. Testu komplekti jāglabā norādītā diapazona glabāšanas temperatūrā un jāizmanto norādītajā darba temperatūrā.
7.4.5. Ir paredzēts, ka imūntestos kvalitatīvās noteikšanas robeža, pamatojoties uz tukšā parauga desmit atkārtotajām analīzēm, ir vienāda ar vidējās un trīskāršās standartnovirzes summu, kas dalīta ar lineārās regresijas vienādojuma virziena koeficientu.
7.4.6. Laboratorijas analīzēs jāizmanto etalonstandarti, lai pārliecinātos, ka reakcija uz standartu ir pieņemamās robežās.
8. Rezultātu paziņošana
8.1. Ciktāl saskaņā ar izmantoto analīzes procedūru iespējams, analīžu rezultātos jānorāda atsevišķu PCDD/F un PCB radniecīgu vielu koncentrācija, norādot apakšējo, augšējo un vidējo robežu, lai ziņojumā iekļautu maksimāli daudz informācijas par rezultātiem un tā radītu iespēju tos interpretēt saskaņā ar īpašām prasībām.
8.2. Ziņojumā jānorāda arī lipīdu saturs paraugā un lipīdu ekstrakcijas metode.
8.3. Ja atgūstamība ir ārpus 6. punktā minētā diapazona gadījumos, kad ir pārsniegta maksimāli pieļaujamā koncentrācija, un citos gadījumos, pēc pieprasījuma jānorāda atsevišķu iekšējo standartu atgūstamība.
1 OJ L 246, 29.8.1981, p. 32.
2 Vēl nav sniegti pierādījumi, ka tirdzniecībā pieejamiem biotestu komplektiem ir pietiekama jutība un ticamība, lai tos izmantotu dioksīnu klātbūtnes skrīningam vajadzīgajos līmeņos pārtikas un barības paraugos.
Zemkopības ministrs M.Roze
48.pielikums
Zemkopības ministrijas
2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9
Dzīvnieku izcelsmes barības sastāvdaļu mikroskopiska noteikšana, identifikācija vai novērtēšana
1. Mērķis un darbības sfēra
Šie nosacījumi tiek izmantoti, ja dzīvnieku izcelsmes barības sastāvdaļu (kas tiek definētas kā no pārstrādājamajiem ķermeņiem iegūtie produkti un zīdītāju, mājputnu un zivju ķermeņu daļas) noteikšana, tiek veikta ar mikroskopisku izmeklējumu palīdzību saskaņotas inspekciju programmas ietvaros dzīvnieku barošanas jomā saskaņā ar Padomes Direktīvu 95/53/EK. Ar noteikumu, ka šajā pielikumā izklāstītās metodes tiek piemērotas visās oficiālajās pārbaudēs, otro pārbaudi var veikt izmantojot arī šīs metodes variantu vai alternatīvu metodi, lai uzlabotu konkrētu dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu veidu noteikšanu vai tālāk precizētu šādu sastāvdaļu izcelsmi. Bez tam, izmeklējot konkrētu dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļas– plazmu vai kaulu taukus (sk. arī 9.punktu), var izmantot atšķirīgu procedūru, ja šīs analīzes tiek veiktas papildus saskaņotajā inspekciju programmā paredzētajām analīzēm.
2. Jūtība
Atkarībā no dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu veida barībā iespējams konstatēt ļoti mazus to daudzumus (<0,1 %).
3. Princips
Identifikācijai izmanto pienācīgi sagatavotu reprezentatīvu paraugu, kas noņemts atbilstoši noteikumiem, kuri ir izklāstīti Komisijas 1976.g. 1.marta Direktīvā 76/371/EEK, ar kuru nosaka Kopienas paraugu noņemšanas metodes barības oficiālajai kontrolei1. Šāda procedūra ir izmantojama, rīkojoties ar barību ar zemu mitruma saturu. Barība, kurā mitruma saturs ir augstāks par 14%, pirms tā tiek izmeklēta, tiek izžāvēta (kondensēta). Ar speciālo barību vai barības materiālu (piemēram, tauki, eļļas) ir jārīkojas konkrēti tiem piemērotā veidā (sk. 9.punktu). Dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļas tiek identificētas, balstoties uz tipiskām, mikroskopiski identificējamām īpašībām (piemēram, muskuļu šķiedras un citas gaļas daļiņas, skrimšļi, kauli, ragi, mati, sari, asinis, spalvas, olu čaumalas, zivju asakas, zvīņas). Identifikācija jāveic gan parauga sijātā frakcijā (6.1), gan koncentrētās nogulsnēs (6.2).
4. Reaģenti
4.1. Audu preparātu ieslēdzošā viela:
4.1.1.Hloralhidrāts (šķīdums ūdenī, 60%m/V);
4.1.2. Sārms (NaOH 2,5% m/V vai KOH 2,5% m/V) sijātām frakcijām;
4.1.3. Parafīneļļa vai glicerols (viskozitāte: 68–81) mikroskopiskiem izmeklējumiem nogulsnēs.
4.2. Skalojamie līdzekļi:
4.2.1. Spirts– 96%;
4.2.2. Acetons.
4.3. Koncentrējošs līdzeklis– tetrahloretilēns (blīvums 1,62)
4.4. Krāsojošie reaģenti:
4.4.1. Joda/kālija šķīdums (izšķīdina 2g kālija 100 ml ūdens un pievieno 1g joda, bieži sakratot);
4.4.2. Sarkanais alizarīns (izšķīdina 2,5ml 1M hlorūdeņraža skābes 100 ml ūdens un pievieno šim šķīdumam 200mg sarkanā alizarīna);
4.4.3. Cistīna reaģents ( 2g svina acetāta, 10g NaOH/100 ml H2O);
4.4.4. Joda– kālija jodīda šķīdums (izšķīdināts 70% etanola).
4.5. Balinoši reaģenti– rūpniecisks nātrija hipohlorīda šķīdums (9.6% aktīvā hlora)
5. Iekārtas un piederumi
5.1. Analītiskie svari (precizitāte 0,01g, izņēmums– koncentrētas nogulsnes: 0,001g)
5.2. Smalcinātaji (dzirnavas vai miezeris, īpaši barības ar 15% tauku saturu analīzei)
5.3. Siets ar maksimāli 0,50 mm platām kvadrātveida acīm
5.4. Separatora piltuve vai konusveida nogulsnēšanas mērglāze
5.5. Stereomikroskops (minimālais palielinājums 40’)
5.6. Saliktais optiskais mikroskops (minimālais palielinājums 400’) caurejoša gaisma/polarizēta gaisma
5.7. Laboratorijas standarta stikla trauki
Visas iekārtas rūpīgi tīra. Separatora piltuves un stikla traukus mazgā trauku mazgājamā mašīnā. Sietus tīra ar suku, kurai ir cieti sari.
6. Darba gaita
6.1. Granulētu barību iepriekš izsijā, ja abas frakcijas tiek analizētas kā atsevišķi paraugi.
6.2. Izmeklē vismaz 50g parauga (vajadzības gadījumā uzmanīgi samaltu, izmantojot atbilstošu smalcināšanas iekārtu (5.2.), lai iegūtu atbilstošu struktūru). Sasmalcināto paraugu sadala divās reprezentatīvās daļās, no tām viena (vismaz 5g) paredzēta sijātai frakcijai (6.1.) un otra, (vismaz 5g) koncentrētajām nogulsnēm (6.2.). Identifikācijas nolūkā var papildus iekrāsot ar krāsojošajiem reaģentiem.
6.3. Lai norādītu dzīvnieku izcelsmes proteīnu raksturu un daļiņu izcelsmi, var izmantot lēmuma atbalsta sistēmu, tādu kā “Aries”, un var dokumentēt references paraugu.
6.4. Dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu identifikācija sijātā frakcijā
6.4.1. Vismaz 5g parauga izsijā cauri sietam (5.3.) divās frakcijās. Sijāto frakciju (–as) (vai frakcijas reprezentatīvo daļu) izmanto plānas kārtiņas veidā uz piemērota balsta un regulāri pārbauda zem stereomikroskopa (5.5.) ar dažādiem palielinājumiem, nosakot dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu klātbūtni.
6.4.2. Priekšmetstikliņus ar sijāto frakciju (–ām) regulāri pārbauda zem saliktā optiskā mikroskopa (5.6.) ar dažādiem palielinājumiem par dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu klātbūtni.
6.5. Dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu identifikācija koncentrētās nogulsnēs
6.5.1. Vismaz 5g parauga (ar precizitāti līdz 0,01g) ievieto separatora piltuvē vai konusveida nogulsnēšanas mērglāzē un apstrādā ar vismaz 50 ml tetrahloretilēna (4.3.1.). Maisījumu atkārtoti sakrata vai izmaisa.
6.5.2. Ja tiek izmantota slēgtā separatora piltuve, nogulsnes tiek atstātas uz pietiekami ilgu laiku (vismaz trīs minūtes) pirms nogulšņu atdalīšanas. Atkārtoti sakrata un nogulsnes atkal atstāj vismaz uz trijām minūtēm. Nogulsnes atkal tiek atdalītas.
6.5.3. Ja tiek izmantota atvērta mērglāze, nogulsnes pirms to atdalīšanas atstāj vismaz uz piecām minūtēm.
6.5.4. Kopējais nogulšņu daudzums tiek izžāvēts un pēc tam nosvērts (ar precizitāti līdz 0,001g). Svēršana ir nepieciešama, ja nepieciešams izvērtējums. Ja nogulsnes sastāv no daudzām lielām daļiņām, tās var izsijāt cauri sietam (5.3.) divās frakcijās. Izžāvētās nogulsnes apseko zem stereomikroskopa (5.5.) un saliktā optiskā mikroskopa (5.6.), lai noteiktu kaulu sastāvdaļas.
6.3. Audu preparātu ieslēdzošo vielu un krāsojošo reaģentu izmantošana.
Mikroskopisko dzīvnieku izcelsmes barības sastāvdaļu identifikāciju var uzlabot, izmantojot speciālas audu preparātu ieslēdzošas vielas un krāsojošos reaģentus.
|
Hlorhidrāts (4.1.1.): |
Rūpīgi sildot, šūnu struktūras ir skaidrāk redzamas tādēļ, ka cietes graudi sarec un izdalās nevajadzīgais šūnu saturs |
|
Sārms (4.1.2.): |
Vai nu nātrija hidroksīds, vai kālija hidroksīds attīra barības materiālu, tādā veidā palīdzot noteikt muskuļu šķiedras, matus un citas keratīna struktūras |
|
Parafīneļļa un glicerols (4.1.3.) |
Šajās audu ieslēdzošajās vielās var labi identificēt kaulu sastāvdaļas tādēļ, ka lielākā daļa poru piepildās ar gaisu un parādās kā melni caurumi aptuveni 5–15 µm. |
|
Joda/kālija jodīda šķīdums (4.4.1.) |
Tiek izmantots cietes (zili violetā krāsā) un proteīna (dzelteno oranžā krāsā) noteikšanai. Šķīdumus var atšķaidīt, ja nepieciešams. |
|
Sarkanā alizarīna šķīdums (4.4.2.) |
Kaulu, zivju asaku un zvīņu krāsa ir sarkanā/rozā. Pirms žāvēšanas nogulsnes (sk. 6.2 apakšpunktu), kopējo nogulšņu daudzumu ievieto stikla mēģenē un divas reizes izskalo ar aptuveni 5 ml spirta (4.2.1.) (katru reizi tiek izmantots “vortex”, šķīdumu atstāj izgulsnēties apmēram vienu minūti un nolej). Pirms krāsojošā reaģenta izmantošanas nogulsnes tiek balinātas, pievienojot vismaz 1 ml nātrija hidroksīda šķīduma (4.5.1.). Ļauj reakcijai turpināties 10 minūtes. Mēģeni piepilda ar ūdeni, nogulsnēm ļauj nosēsties divas līdz trīs minūtes un pēc tam ūdeni un nenogulsnējušās daļiņas nolej. Nogulsnes skalo vēl divas reizes ar 10 ml ūdens (tiek izmantots “vortex”, ļauj nosēsties, un katru reizi ūdens tiek noliets). Pievieno divus līdz desmit pilienus sarkanā alizarīna šķīduma. Maisījumu sakrata un ļauj reakcijai turpināties dažas sekundes. Iekrāsotās nogulsnes tiek divas reizes noskalotas ar aptuveni 5 ml spirta (4.2.1.), pēc tam vienu reizi ar acetonu (4.2.2.) (katru reizi tiek izmantots “vortex”, šķīdinātājam ļauj nosēsties aptuveni vienu minūti un tad to nolej). Tagad nogulsnes ir gatavas žāvēšanai. |
|
Cistīna reaģents (4.4.3.): |
Uzmanīgi karsējot, sastāvdaļas, kurās ir cistīns (mati, spalvas utt.) kļūst melni brūnas |
6.4. Izmeklējumi barībai, kura, iespējams, satur zivju miltus
6.4.1. Zem saliktā optiskā mikroskopa ir jāizmeklē vismaz viens priekšmetstikliņš, kas ņemts no smalkas izsijātas frakcijas un smalkas nogulšņu frakcijas (skatīt 6.1. un 6.2.apakšpunktu).
6.4.2. Ja uz etiķetes ir norādīts, ka sastāvdaļas satur zivju miltus, vai ir aizdomas par zivju miltu klātbūtni, vai zivju milti ir konstatēti sākotnējos izmeklējumos, tad tiek izmeklēti vismaz divi papildu sākotnējā parauga un kopējās nogulšņu frakcijas priekšmetstikliņi, kas ņemti no smalkas izsijātas frakcijas.
7. Rezultātu aprēķināšana un vērtējums
7.1. Dalībvalstis nodrošina, ka šajā punktā izklāstītā procedūra tiek izmantota, ja tiek veikta oficiāla analīze ar mērķi aprēķināt dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu daudzumu (ne tikai klātbūtni).
7.2. Aprēķinu var veikt tikai tad, ja dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļas satur kaulu daļiņas.
7.3. Siltasiņu sauszemes dzīvnieku sugu (piemēram, zīdītāji un putni) kaulu daļas uz mikroskopa priekšmetstikliņa var atšķirt no dažāda veida zivju asakām pēc tipiskām porām. Tiek aprēķināts dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu īpatsvars paraugā, ņemot vērā:
7.3.1. aprēķināto kaulu daļiņu īpatsvaru (masu %) koncentrētās nogulsnēs;
7.3.2. kaulu daļiņu īpatsvaru (masu %) dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļās.
7.4. Aprēķini ir jābalsta uz vismaz trijiem (ja iespējams) priekšmetstikliņiem un vismaz piecām jomām uz katru priekšmetstikliņu. Kombinētajā barībā koncentrētās nogulsnes kā likums, satur ne tikai sauszemes dzīvnieku kaulu un zivju asaku fragmentus, bet arī citas daļiņas, kurām ir liels specifiskais svars, piemēram, minerālus, smiltis, pārkoksnējušos augu fragmentus un līdzīgas daļiņas.
7.5. Kaulu fragmentu novērtētā procentuālā vērtība:
7.5.1. % sauszemes dzīvnieku kaulu fragmenti = (S x c)/W
7.5.2. % zivju asaku un zvīņu fragmenti= (C x d)/W
(S = nogulšņu masa (mg), c = korekcijas koeficients (%) novērtētai sauszemes dzīvnieku kaulu daļai nogulsnēs, d = korekcijas koeficients (%) novērtētai zivju asaku un zvīņu daļai nogulsnēs, W = nogulšņu parauga materiāla masa (mg)).
7.6. Dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu novērtētā procentuālā vērtība
7.6.1. Kaulu proporcija dzīvnieku produktos var būt ļoti dažāda. (Kaulu procentuālais daudzums kaulu miltiem ir 50 līdz 60% un gaļas miltiem ir 20 līdz 30%; zivju miltiem asaku un zvīņu saturs ir atšķirīgs atkarībā no zivju miltu kategorijas un izcelsmes, parasti tas ir 10 līdz 20%).
7.6.2. Ja ir zināms, kāda veida dzīvnieku milti atrodas paraugā, tad ir iespējams novērtēt saturu:
7.6.2.1. Novērtētais sauszemes dzīvnieku produktu sastāvdaļu saturs (%) = (S x c)/(W x f) x 100;
7.6.2.2. Novērtētais zivju produktu sastāvdaļu saturs (%) = (S x d)/(W x f) x 100.
(S = nogulšņu masa (mg), c= korekcijas koeficients (%) novērtētai sauszemes dzīvnieku kaulu daļai nogulsnēs, d= korekcijas koeficients (%) novērtētai zivju asaku un zvīņu daļai nogulsnēs, f = korekcijas koeficients kaulu daļai pārbaudāmajā paraugā esošajām dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļām, W = nogulšņu parauga materiāla masa (mg)).
8. Izmeklējumu rezultātu noformēšana
Ziņojums satur vismaz informāciju par to sastāvdaļu klātbūtni, kuru izcelsme ir sauszemes dzīvnieki un zivju milti. Citi gadījumi tiek ziņoti šādi:
8.1. Attiecībā uz sauszemes dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu klātbūtni:
– ciktāl mikroskopā saskatāms, iesniegtajā paraugā sauszemes dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu klātbūtne netika konstatēta;
vai
– ciktāl mikroskopā saskatāms, iesniegtajā paraugā tika konstatēta sauszemes dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu klātbūtne.
8.2. Attiecībā uz zivju miltu klātbūtni:
8.2.1. ciktāl mikroskopā saskatāms, iesniegtajā paraugā zivju izcelsmes sastāvdaļu klātbūtne netika konstatēta;
vai
8.2.2. ciktāl mikroskopā saskatāms, iesniegtajā paraugā tika konstatēta zivju izcelsmes sastāvdaļu klātbūtne.
8.3. Ja konstatē, ka sastāvdaļas satur zivju vai sauszemes dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļas, ziņojumā par izmeklējuma rezultātiem, ja nepieciešams, var uzrādīt atrasto sastāvdaļu masas novērtējumu (x%, <0,1%, 0,1–0,5%, 0,5–5% vai >5%), tālāk precizēt, ja iespējams, sauszemes dzīvnieka veidu un identificētās dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļas (muskuļu šķiedras, skrimšļi, kauli, ragi, mati, spalvas, asinis, olu čaumalas, zivju asakas, zvīņas).
8.4. Ja novērtē dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu daudzumu, tad min, ka ir piemērots korekcijas koeficients f.
8.5. Ja konstatē sauszemes dzīvnieku kaulu sastāvdaļas, tad ziņojumā ietver papildu teikumu:
8.6. “Nav izslēgta iespēja, ka augstākminētajām sastāvdaļām ir zīdītājdzīvnieku izcelsme”.
8.7. Šis papildus teikums nav nepieciešams, ja sauszemes dzīvnieku kaulu fragmenti ir uzskaitīti kā mājputnu vai zīdītāju kaulu fragmenti.
9. Tauku vai eļļas analīžu procedūras variants
Taukus vai eļļas var analizēt, izmantojot šādu procedūru:
9.1. Ja tauki ir cieti, tos uzsilda, piemēram, mikroviļņu krāsnī, līdz tie kļūst šķidri;
9.2. Izmantojot pipeti, ņem 40 ml tauku no parauga dibena un ievieto centrifūgas kamerā;
9.3. Centrifugē 10 minūtes ar 4 000 apgriezieniem minūtē (rpm);
9.4. Ja pēc centrifugēšanas tauki ir cieti, tos vēlreiz uzsilda krāsnī, līdz tie kļūst šķidri. Atkārto centrifugēšanu piecas minūtes ar 4 000 apgriezieniem minūtē (rpm);
9.5. Ar mazu karotīti vai lāpstiņu pusi dekantētā piesārņojuma pārnes uz mazu Petri trauciņu vai mikroskopa priekšmetstikliņu, lai ar mikroskopu noteiktu dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu iespējamo saturu (gaļas šķiedras, spalvas, kaulu fragmenti). Parafīneļļa vai glicerīns ir ieteicams kā audus ietverošs līdzeklis;
9.6. Palikušo piesārņojumu izmanto izgulsnēšanai, kā aprakstīts 6.2.apakšpunktā.
Zemkopības ministrs M.Roze