I. Vispārīgie jautājumi

1. Noteikumi nosaka kārtību, kādā tiek apkarota kartupeļu tumšā gredzen­puve un ierobežota tās izplatība.

2. Kartupeļu tumšo gredzenpuvi ierosina augu karantīnas organisms Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuci et al. (turpmāk - organisms).

3. Lai konstatētu kartupeļu tumšo gredzenpuvi, Valsts augu aizsardzības dienests (turpmāk - dienests):

3.1. regulāri pārbauda kartupeļu Solanum tuberosum L. augus un to bumbuļus (turpmāk - kartupeļi) un ēdamā tomāta Lycopersicon esculentum Mill. (syn. Lycopersicon lycopersicum (L.) H. Karsten) augus, izņemot augļus un sēklas (turpmāk - saimniekaugs);

3.2. ņem sēklas un citai izmantošanai paredzēto kartupeļu paraugus uzglabāšanas vietās un nosūta tos laboratoriskai testēšanai;

3.3. pārbauda kartupeļus vizuāli, pārgriežot kartupeļu bumbuļus. Ja tiek konstatētas kartupeļu tumšās gredzenpuves vizuālās pazīmes, ņem kartupeļu paraugus un nosūta tos laboratoriskai testēšanai;

3.4. izvērtējot organisma izplatīšanās risku, pārbauda:

3.4.1. nakteņu Solanacea dzimtas au­gus, ieskaitot šīs dzimtas savvaļas augus (turpmāk - citi organisma saimniekaugi);

3.4.2. virszemes ūdeņus, ko izmanto saimniekaugu apūdeņošanai un laistīšanai;

3.4.3. uzņēmumu, kas nodarbojas ar saimniekaugu pārstrādi un iepakošanu, šķidros atkritumus, ko izmanto saimniek­augu apūdeņošanai un laistīšanai;

3.4.4. augšanas substrātu, augsni un ražošanas cietos atkritumus no saimniekaugu pārstrādes un iepakošanas uzņēmumiem;

3.5. pārbauda ūdenskrātuves un ņem ūdens paraugus laboratoriskai testēšanai, ja saņemta informācija no citas Eiropas Savienības dalībvalsts, ka tajā inficēto saim­niekaugu laistīšanai izmantots virszemes ūdens, kas ietek Latvijā;

3.6. diagnosticē organismu saskaņā ar šo noteikumu 1., 2., 3. un 4.pielikumu;

3.7. organisma izolācijai un audzēšanai izmanto šo noteikumu 5.pielikumā minētās barotnes;

3.8. testu procedūrām izmanto šo noteikumu 6.pielikumā minētos buferšķīdumus;

3.9. inficēšanās līmeņus nosaka saskaņā ar šo noteikumu 7.pielikumu;

3.10. laboratoriskās analīzes veic saskaņā ar šo noteikumu 8., 9. un 10.pielikumu;

3.11. nosaka, kontrolē un piespiedu kārtā veic organisma izplatības ierobežošanas un apkarošanas pasākumus (turpmāk - fitosanitārais pasākums).

4. Personas nedrīkst uzglabāt vai pavairot kartupeļu tumšās gredzenpuves ierosinātāja tīrkultūru, izņemot atsevišķus gadījumus, kas noteikti normatīvajos aktos par izmēģinājumiem vai zinātniskiem mērķiem un šķirņu selekcijai paredzēto kaitīgo organismu, augu, augu produktu un ar tiem saskarē nonākušo priekšmetu ievešanu un pārvietošanu.

II. Fitosanitāro pasākumu noteikšana

5. Ja, veicot laboratorisko testēšanu saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikumā minēto ātrās diagnostikas testu - imunofluorescences testu (turpmāk - IF), iegūts pozitīvs rezultāts un tas ir apstiprināts ar polimerāzes ķēdes reakcijas (turpmāk - PCR) testu vai in situ fluorescences hibridizācijas (turpmāk - FISH) testu, dienests pieņem lēmumu par šādu fitosanitāro pasākumu noteikšanu:

5.1. aizliedz pārvietot saimniekaugu bumbuļu vai augu partiju, vai kravas no saimniecības, kur tika ņemts paraugs, izņemot gadījumus, ja saimniekaugi tiek pārvietoti dienesta uzraudzībā un ir novērsts organisma izplatīšanās risks;

5.2. pēc organisma izplatīšanās riska izvērtēšanas aizliedz personai pārvietot no saimniecības citus saimniecībā audzētos saimniekaugus;

5.3. veic pasākumus, lai noskaidrotu organisma klātbūtnes iespējamo cēloni.

6. Ja turpmākajos laboratoriskajos testos saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikumā noteiktajiem biopatogenitātes un identifikācijas testiem paraugā organisms netiek konstatēts, dienests atceļ noteiktos fitosanitāros pasākumus.

7. Lai noteiktu organisma izcelšanās vietu, dienests pārbauda kartupeļu partijas, kas bijušas saistītas ar šo noteikumu 5.punktā minētajiem kartupeļiem.

8. Ja turpmākajos laboratoriskajos testos saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikumā noteiktajiem biopatogenitātes un identifikācijas testiem paraugā tiek konstatēts organisms, dienests apstiprina kartupeļu tumšo gredzenpuvi.

9. Ja konstatēts organisms, dienests pieņem lēmumu par fitosanitāro pasākumu piemērošanu saskaņā ar šo noteikumu 10., 11., 12., 13., 14. un 15.punktu.

10. Lai noteiktu organisma izplatību un atzīmētu zemesgabala plānā inficēto zonu (lauku, audzēšanas vietu un saimniecības, kas jebkādā veidā ir saistītas ar inficētajiem kartupeļiem), par inficētiem nosaka:

10.1. saimniekaugus un to kravas vai partijas, no kurām ņemts paraugs (turpmāk - inficētie saimniekaugi);

10.2. noliktavu vai tās daļu, lauksaimniecības tehniku un transportlīdzekli, kas bijis saskarē ar inficētajiem saimniekaugiem;

10.3. citus priekšmetus, ieskaitot iepakojumu, kas bijis saskarē ar inficētajiem saimniekaugiem;

10.4. lauku, segto platību un audzēšanas vietu, no kuras iegūta inficēto saimniekaugu raža;

10.5. lauku, segto platību un audzēšanas vietu, kur saimniekaugu veģetācijas periodā ņemti saimniekaugu paraugi;

10.6. citus saimniekaugus, no kuriem ir ņemts paraugs;

10.7. virszemes ūdeņus, no kuriem ņemts paraugs.

11. Lai noteiktu organisma izplatību un zemesgabala plānā atzīmētu inficēto zonu, par iespējami inficētiem nosaka:

11.1. visus saimniekaugus, kas audzēti audzēšanas vietā, kurā noteikti šo noteikumu 10.punktā minētie ierobežojumi;

11.2. audzēšanas vietas, kas ir saistītas ar inficētajiem saimniekaugiem, arī audzēšanas vietas, kam ir kopīga lauksaimniecības tehnika, transportlīdzekļi un telpas ar audzēšanas vietu, kurā ir konstatēti inficētie saimniekaugi;

11.3. saimniekaugus, kas ir izaudzēti šo noteikumu 11.2.apakšpunktā minētajās audzēšanas vietās vai pēc organisma konstatēšanas atradušies audzēšanas vietā, kas noteikta par inficētu;

11.4. noliktavas vai telpas, kurās tiek uzglabāti vai apstrādāti saimniek­augi no šo noteikumu 11.2.apakšpunktā minētajām audzēšanas vietām;

11.5. iekārtas, lauksaimniecības tehniku, transportlīdzekļus, noliktavas vai to daļas un citus priekšmetus, ieskaitot traukus un iepakojumu, kas iepriekšējo 12 mēnešu laikā varēja nonākt saskarē ar inficētajiem saimniekaugiem;

11.6. saimniekaugus, kas nonākuši saskarē ar šo noteikumu 11.5.apakšpunktā minētajiem objektiem pirms to tīrīšanas un dezinfekcijas;

11.7. kartupeļus, kuri ir saistīti ar inficētās sēklas kartupeļu partijas izcelsmi, vai tomātus, kuri iegūti vienā audzēšanas vietā ar inficētajiem tomātiem, ja saskaņā ar šo noteikumu 6.punktā minētajiem pārbaužu un testēšanas rezultātiem organisms netika konstatēts, tomēr ir risks, ka organisms izplatījies, augus pavairojot;

11.8. audzēšanas vietas, kurās audzē šo noteikumu 11.7.apakšpunktā minētos saimn­iekaugus;

11.9. saimniekaugu audzēšanas vietas, kurās apūdeņošanai vai laistīšanai lieto ūdeņus, kas noteikti par inficētiem;

11.10. saimniekaugus, kas izaudzēti laukos, kuri applūduši ar virszemes ūdeņiem, kas noteikti kā inficēti.

12. Dienests nosaka šādus fitosanitāros pasākumus:

12.1. aizliedz stādīt inficētos un iespējami inficētos saimniekaugus;

12.2. uzdod veikt vienu no šādiem pasākumiem:

12.2.1. dienesta uzraudzībā sadedzināt inficētos saimniekaugus;

12.2.2. pēc termiskās apstrādes, kas iznīcina organismu, inficētos saim­niekaugus izlietot lopbarībai;

12.2.3. inficētos saimniekaugus dziļi aprakt atkritumu izgāztuvēs, no kurām organismam nav iespējams nokļūt lauksaimniecībā izmantojamā zemē un kurām nav saskares ar ūdenskrātuvēm, ko varētu izmantot lauksaimniecības zemju apūdeņošanai vai laistīšanai;

12.2.4. rūpnieciski pārstrādāt inficētos saimniekaugus, nekavējoties nogādājot tos tieši pārstrādes uzņēmumā, kuram ir piemērotas atkritumu pārstrādes iekārtas, noliktavas un izbraucošu transportlīdzekļu tīrīšanas un dezinficēšanas iekārtas;

12.2.5. saimniekaugu cietos ražošanas atkritumus (arī izbrāķētos saimniekaugus un to mizas) un jebkurus citus cietos atkritumus (piemēram, augsni, akmeņus un citus nosēdumus), kas bijuši saskarē ar saim­niekaugiem:

12.2.5.1. aprakt atkritumu izgāztuvēs, nogādājot ražošanas atkritumus tieši izgāztuvē un nodrošinot, lai ceļā nerastos to zudumi un organismam nebūtu iespējas nokļūt lauksaimniecībā izmantojamā zemē, kā arī šai vietai nebūtu saskares ar ūdenskrātuvēm, kuru ūdeņus var izmantot lauksaimniecības zemju apūdeņošanai vai laistīšanai;

12.2.5.2. iznīcināt;

12.2.5.3. veikt citus fitosanitāros pasākumus, ja ir novērsts organisma izplatīšanās risks;

12.2.6. saimniekaugu šķidros ražošanas atkritumus:

12.2.6.1. ja tie satur cietās daļiņas, pirms izgāšanas filtrēt vai nosēdināt cietās daļiņas, lai tās atdalītu, un cietos atkritumus aprakt vai iznīcināt saskaņā ar šo noteikumu 12.2.5.1. un 12.2.5.2.apakšpunktu;

12.2.6.2. pirms to izgāšanas karsēt vismaz 30 minūtes minimālajā temperatūrā 60 ºC;

12.2.6.3. veikt citus fitosanitāros pasākumus, nodrošinot aizsardzību pret organisma nokļūšanu lauksaimniecībā izmantojamā zemē un ūdenskrātuvēs, kuras var izmantot lauksaimniecības zemes apūdeņošanai vai laistīšanai;

12.2.7. veikt citus fitosanitāros pasākumus, ja ir novērsts organisma izplatīšanās risks;

12.2.8. iespējami inficētos kartupeļu bumbuļus:

12.2.8.1. dienesta uzraudzībā izlietot citiem mērķiem (piemēram, pārtikā vai nosūtīt pārdošanai tieši tirdzniecības vietās). Kartupeļu bumbuļus tirdz­niecības vietā nogādā iepakotus. Stādīšanai paredzētos kartupeļus pēc tīrīšanas un dezinfekcijas drīkst apstrādāt tajā pašā vietā;

12.2.8.2. rūpnieciski pārstrādāt pārtikas kartupeļus, iesaiņojot un nekavējoties nogādājot tieši pārstrādes uzņēmumā, kuram ir piemērotas atkritumu apglabāšanas un dezinficēšanas iekārtas un izbraucošo transport­līdzekļu tīrīšanas un dezinficēšanas iekārtas;

12.2.8.3. veikt citus fitosanitāros pasākumus saskaņā ar normatīvajiem aktiem augu karantīnas jomā, ja novērsts organisma izplatīšanās risks;

12.2.9. citas saimniekaugu daļas, ieskaitot stumbrus un lapas:

12.2.9.1. iznīcināt;

12.2.9.2. veikt citus fitosanitāros pasākumus saskaņā ar normatīvajiem aktiem augu karantīnas jomā, ja novērsts organisma izplatīšanās risks.

13. Dienests uzdod personai laukos un segtajās platībās audzēšanas vietās, kas noteiktas par inficētām, atbilstoši lauka izmantošanas intensitātei izvēlēties un veikt vienu no šādiem pasākumiem:

13.1. ja fitosanitāros pasākumus piemēro vismaz piecus gadus pēc organisma konstatēšanas:

13.1.1. četrus gadus pēc organisma konstatēšanas:

13.1.1.1. iznīcināt pārziemojušos kartupeļus, tomātu augus, nakteņu dzimtas nezāles un citus organisma saimniekaugus;

13.1.1.2. nedrīkst stādīt kartupeļu bumbuļus un augus, tomātu stādus, Brassica ģints augus un citus saimniekaugus, kā arī sēt to sēklas, ja tas varētu izplatīt organismu;

13.1.2. ja vismaz divos iepriekšējos veģetācijas periodos nav atrasti pārziemojuši kartupeļi, tomātu augi, nakteņu dzimtas nezāles un citi organisma saimniekaugi, piektajā audzēšanas gadā drīkst stādīt kartupeļus, lai iegūtu kartupeļus pārtikai, pārstrādei vai lopbarībai. Minētos kartupeļus pēc ražas novākšanas dienests pārbauda saskaņā ar šo noteikumu 3.punktu;

13.1.3. pirmajā kartupeļu vai tomātu audzēšanas gadā, ievērojot augu seku, dienests veic šo noteikumu 3.punktā minētās pārbaudes;

13.2. ja fitosanitāros pasākumus piemēro sešus gadus pēc organisma konstatēšanas:

13.2.1. iznīcināt pārziemojušos kartupeļus, tomātu augus, nakteņu dzimtas nezāles un citus organisma saimniekaugus;

13.2.2. pirmajos trijos veģetācijas periodos laukā ierīkot un uzturēt melno papuvi, ganības, kuras bieži un zemu nopļauj vai intensīvi nogana, sēt zālājus sēklu iegūšanai vai graudaugus;

13.2.3. nākamajos divos veģetācijas periodos laukā audzēt augus, kuri nav saimniekaugi;

13.2.4. nākamajā kartupeļu vai tomātu audzēšanas sezonā, kas seko šo noteikumu 13.2.2. un 13.2.3.apakšpunktā minētajam periodam, drīkst audzēt kartupeļus sēklas ieguvei vai citiem mērķiem (piemēram, pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētu kartupeļu ieguvei. Iegūtos bumbuļus testē saskaņā ar šo noteikumu 1., 2., 3. un 4.pielikumu.

14. Pēc pārziemojušo kartupeļu, tomātu augu, nakteņu dzimtas nezāļu un citu organismu saimniekaugu izplatīšanās riska novēršanas dienests organisma inficētajā zonā - laukos vai audzēšanas vietās, kas nav minētas šo noteikumu 13.punktā, ievērojot augu seku:

14.1. pirmajā veģetācijas periodā pēc organisma konstatēšanas aizliedz stādīt kartupeļu bumbuļus, to augus vai citus organisma saimniekaugus un uzdod iznīcināt pārziemojušos kartupeļus, tomātu augus un citus organisma saimniekaugus vai atļauj stādīt tikai sertificētus sēklas kartupeļus citiem mērķiem paredzētu kartupeļu (pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) ieguvei, ja ir iznīcināti visi pārziemojušie kartupeļi, tomātu augi un citi organisma saimniekaugi;

14.2. otrajā veģetācijas periodā pēc infekcijas noteikšanas drīkst stādīt sertificētus sēklas kartupeļus sēklas un citiem mērķiem (pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētu kartupeļu ieguvei;

14.3. trešajā veģetācijas periodā pēc infekcijas noteikšanas atļauts sēklas vai citiem mērķiem (pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētu kartupeļu ieguvei stādīt sertificētus sēklas kartupeļus vai kartupeļus, kuri tieši iegūti no sertificētiem sēklas kartupeļiem un ir pārbaudīti dienestā;

14.4. katrā šo noteikumu 14.2. un 14.3.apakš­punktā minētajā veģetācijas periodā uzdod iznīcināt pārziemojušos kartupeļus, tomātu augus un citus organisma saimniekaugus. Novāktos bumbuļus testē saskaņā ar šo noteikumu 1., 2., 3. un 4.pielikumu.

15. Dienests nosaka šādus fitosanitāros pasākumus:

15.1. segtajās platībās aizliedz stādīt kartupeļu bumbuļus un to augus vai sēklas, kā arī citus organisma saimniekaugus, izņemot gadījumus, ja kartupeļu audzēšanai izmantoti sertificēti sēklas kartupeļi, sīkbumbuļi vai meristēmaugi, kuri ir pārbaudīti dienestā, un ir pilnīgi nomanīts augšanas substrāts, kā arī ir iztīrītas un dezinficētas segtās platības un iekārtas. Lai novērstu organisma izplatīšanos, dienests veic apūdeņošanas un laistīšanas sistēmas uzraudzību;

15.2. uzdod personai dienesta uzraudzībā:

15.2.1. attīrīt vai dezinficēt inficētās vai iespējami inficētās noliktavas, lauksaimniecības tehniku, transportlīdzekļus un citus priekšmetus, iznīcināt vai dezinficēt ar inficētajiem un iespējami inficētajiem saimniekaugiem saskarē nonākušo iepakojumu. Minētos objektus pēc dezinfekcijas vairs neuzskata par inficētiem vai iespējami inficētiem;

15.2.2. tūlīt pēc organisma noteikšanas un katrā nākamajā veģetācijas periodā līdz pirmajam atļautajam kartupeļu audzēšanas gadam laukos, kuri bija noteikti kā inficēti, veikt visas ar kartupeļu audzēšanu saistītās lauksaimniecības tehnikas un noliktavu, segto platību tīrīšanu un, ja iespējams, arī dezinfekciju;

15.3. audzēšanas vietās, kas atrodas inficētajā zonā, vismaz trīs gadus pēc organisma konstatēšanas personai uzdod:

15.3.1. sēklas kartupeļus novākt, uzglabāt un pārvietot atsevišķi no citiem mērķiem (piemēram, pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētajiem kartupeļiem vai pēc sēklas kartupeļu un pirms pārtikas kartupeļu apstrādes veikt tīrīšanas un dez­infekcijas pasākumus;

15.3.2. veikt lauksaimniecības tehnikas, noliktavu un ražošanas vietu tīrīšanu un, ja iespējams, arī dezinfekciju;

15.3.3. visās audzēšanas vietās, kas noteiktas par iespējami inficētām, izmantot tikai sertificētus sēklas kartupeļus un novāktos bumbuļus testēt saskaņā ar šo noteikumu 1., 2., 3. un 4.pielikumu.

16. Lai noteiktu organisma iespējamo izplatību un sākotnējo organisma izcelšanās vietu, dienests pārbauda:

16.1. kartupeļus, kas saistīti ar inficēto kartupeļu partiju;

16.2. audzēšanas vietu, kas atrodas netālu no audzēšanas vietas, kurā ir konstatēti inficētie kartupeļi;

16.3. audzēšanas vietu, kas atrodas netālu no pārplūdušajiem virszemes ūdeņiem vai citādā veidā nonākusi saskarē ar inficēto lauku.

17. Lai noteiktu organisma izcelšanās vietu, dienests pārbauda:

17.1. citas ar šo noteikumu 10.1.apakš­punktā minētajiem saimniekaugiem saistītās audzēšanas vietas:

17.1.1. kurās audzē vai audzēja saimniekaugus, kuru izcelsme saistīta ar inficētajiem saimniekaugiem;

17.1.2. kurās audzē vai audzēja saimniekaugus, kurus dienests uzrauga, jo ir aizdomas, ka tie ir inficēti ar organismu;

17.1.3. kurās audzē vai audzēja kartupeļus, kuru izcelsme saistīta ar kartupeļiem audzēšanas vietā, kura noteikta par inficētu ar organismu;

17.1.4. kurās audzē saimniekaugus un kas atrodas blakus audzēšanas vietai, kas noteikta par inficētu, ieskaitot audzēšanas vietas, kas kopīgi izmanto lauksaimniecības tehniku, transportlīdzekļus un telpas ar saimniecību, kurā ir konstatēti inficēti saimniekaugi;

17.1.5. kas apūdeņošanai un laistīšanai izmanto virszemes ūdeņus, kuri ir noteikti par inficētiem vai ir aizdomas, ka tie ir inficēti;

17.1.6. kas apūdeņošanai un laistīšanai izmanto virszemes ūdeņus, kas tiek lietoti kopīgi ar audzēšanas vietām, kas ir noteiktas par inficētām vai ir aizdomas, ka tās ir inficētas;

17.1.7. kas applūdušas vai bijušas applūdušas ar virszemes ūdeņiem, kuri ir noteikti par inficētiem vai ir aizdomas, ka tie ir inficēti;

17.2. virszemes ūdeņus, kas izmantoti apūdeņošanai vai laistīšanai, vai applūdinājuši laukus vai audzēšanas vietas, kas noteiktas par inficētām;

17.3. citus nakteņu dzimtas savvaļas augus.

18. Ja dienests organismu konstatē sākotnējā selekcijas materiālā, dienests pārbauda sākotnējo selekcijas materiālu, izlases sēklas, pirmsbāzes vai bāzes sēklas kartupeļus, kuru izcelsme saistīta ar inficēto sēklas kartupeļu partiju, un paraugu nosūta laboratoriskai testēšanai.

19. Dienests:

19.1. lēmumā norāda fitosanitāro pasākumu izpildes termiņu. Lēmumam pievieno inficētās zonas karti;

19.2. uzrauga un kontrolē fitosanitāro pasākumu izpildi;

19.3. vietās, kas noteiktas par inficētām, pēc ražas novākšanas lēmumā noteiktajā laikā pārbauda kartupeļus;

19.4. pārbauda apūdeņošanas un laistīšanas sistēmas un, ja nepieciešams, nosaka ūdens izmantošanas aizliegumus, lai novērstu organisma izplatīšanās risku;

19.5. uzrauga saimniecības, noliktavas un ar kartupeļu bumbuļu vai tomātu pārvietošanu saistītos uzņēmumus, kā arī audzēšanas vietas, kuras izmanto lauksaimniecības tehniku kopīgi ar audzēšanas vietām, kurās bija konstatēti inficēti kartupeļi.

20. Inficētajā zonā vismaz trīs nākamos veģetācijas periodus pēc infekcijas noteikšanas dienests veic šo noteikumu 3.1. un 3.2.apakšpunktā minētās pārbaudes.

21. Inficētajā zonā, kur virszemes ūdeņi ir noteikti par inficētiem vai iespējami inficētiem, dienests:

21.1. veic regulāras ikgadējas pārbaudes, ņemot ūdens un nakteņu dzimtas augu paraugus un tos testējot saskaņā ar šo noteikumu 1., 2., 3. un 4.pielikumu;

21.2. veic apūdeņošanas un laistīšanas sistēmu uzraudzību un, ja nepieciešams, nosaka ūdens izmantošanas aizliegumus saimniekaugu laistīšanai, lai novērstu organisma izplatīšanās risku. Aizliegumu var atcelt, pamatojoties uz ikgadējo pārbaužu rezultātiem. Ūdeni, uz kuru attiecināts aizliegums, drīkst lietot, ja veikti organisma iznīcināšanas pasākumi un nav iespējama organisma izplatīšanās;

21.3. uzrauga atkritumu savākšanu ar saimniekaugu materiālu saistītajos ražošanas vai iepakošanas uzņēmumos, kuros ir atklāti ar organismu inficēti šķidrie atkritumi.

22. Ja persona nav izpildījusi dienesta noteiktos fitosanitāros pasākumus un inficētajās vai iespējami inficētajās platībās ir iestādījusi inficētos vai iespējami inficētos vai nesertificētus kartupeļus, dienests var piespiedu kārtā ķīmiski vai mehāniski iznīcināt kartupeļu stādījumus. Ar kartupeļu iznīcināšanu saistītos izdevumus sedz persona.

III. Eiropas Komisijas un Eiropas Savienības dalībvalstu informēšana

23. Ja saskaņā ar šo noteikumu 1., 2., 3. un 4.pielikumā minētajām laboratoriskajām metodēm iegūts pozitīvs testēšanas rezultāts un ir aizdomas, ka ar organismu ir inficēts saimniekaugu laistīšanai izmantotais virszemes ūdens, kas ietek no citas Eiropas Savienības dalībvalsts vai iztek uz citu Eiropas Savienības dalībvalsti, dienests par katru šādu gadījumu informē attiecīgo Eiropas Savienības dalībvalsti.

24. Ja ir aizdomas, ka inficētie kartupeļi tiek ievesti dalībvalstī vai izvesti no tās, dienests nekavējoties par šādu gadījumu informē Eiropas Komisiju:

24.1. iesniedz paziņojumu, kurā norāda šādu informāciju:

24.1.1. kartupeļu vai tomātu partijas šķirnes nosaukums;

24.1.2. nosūtītāja un saņēmēja vārds, uzvārds vai nosaukums un adrese;

24.1.3. kartupeļu vai tomātu partijas piegādes datums;

24.1.4. piegādātās kartupeļu vai tomātu partijas lielums;

24.1.5. augu pases numurs vai ražotāja vai tirgotāja reģistrācijas numurs fitosanitārajai kontrolei pakļauto augu un augu produktu apritē iesaistīto personu reģistrā;

24.2. paziņojumam pievieno augu pases kopiju vai piegādes paziņojuma kopiju.

25. Dienests informē Eiropas Komisiju un Eiropas Savienības dalībvalstis par katru organisma konstatēšanas gadījumu. Paziņojumā norāda šādu infor­māciju:

25.1. datums, kad saskaņā ar šo noteikumu 5.punktu iegūts pozitīvs testē­šanas rezultāts, paraugu ņemšanas un organisma konstatēšanas datums, veiktās izmeklēšanas apraksts, lai identificētu inficēšanās avotu un iespējamo infekcijas izplatīšanos (norāda arī, kādā apmērā veikta paraugu ņemšana);

25.2. tās saimniecības reģistrācijas numurs fitosanitārajai kontrolei pakļauto augu un augu produktu apritē iesaistīto personu reģistrā, kurā atrodas audzēšanas vieta, kas noteikta par inficētu, kā arī inficēšanās līmeņa apraksts, ražošanas vieta un kartupeļu partiju skaits. Norāda kartupeļu šķirņu nosaukumus, sēklas kartupeļiem - kategorijas;

25.3. inficētajai saimniekaugu kravai vai partijai pievienoto fitosanitāro sertifikātu vai augu pasu numuri;

25.4. inficēto sēklas vai citiem mērķiem (pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētu kartupeļu šķirņu nosaukumi un kategorijas;

25.5. inficētās zonas un tajās noteikto fitosanitāro pasākumu apraksts;

25.6. šo noteikumu 8.punktā minētās testēšanas rezultāts par ekstraktu, imunofluorescences testēšanai sagatavoto priekšmetstikliņu, inficēto baklažānu (Solanum melongena) materiālu un organisma tīrkultūru;

25.7. par inficētu atzītās ūdenstilpnes apraksts, nosaukums un atrašanās vieta, kā arī inficētās apūdeņošanas lieguma teritorijas lielums.

26. Ja dienests plāno piemērot citus fitosanitāros pasākumus inficēto un iespējami inficēto kartupeļu izmantošanai, pirms šo pasākumu piemērošanas dienests informē par to Eiropas Komisiju un Eiropas Savienības dalībvalstis.

27. Dienests katru gadu līdz 1.jūnijam paziņo Eiropas Komisijai un pārējām Eiropas Savienības dalībvalstīm par iepriekšējā gadā veikto apsekojumu detaļām un rezultātiem. Par pašu saimniecībā stādīšanai atlasīto kartupeļu pārbaudēm paziņojumus nosūta katru gadu līdz 1.septembrim.

IV. Noslēguma jautājums

28. Atzīt par spēku zaudējušiem Ministru kabineta 2005.gada 26.jūlija noteikumus Nr.568 "Kartupeļu tumšās gredzenpuves apkarošanas un izplatības ierobežošanas kārtība" (Latvijas Vēstnesis, 2005, 122.nr.).

Informatīva atsauce uz Eiropas Savienības direktīvām

Noteikumos iekļautas tiesību normas, kas izriet no:

1) Padomes 1998.gada 20.jūlija Direktīvas 98/57/EEK par Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuci et al. kontroli;

2) Komisijas 2006.gada 14.jūlija Direktīvas 2006/63/EK, ar ko groza II un VII pielikumu Padomes Direktīvā 98/57/EK par Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. apkarošanu.

Ministru prezidents A.Kalvītis

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
1.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.364

Kartupeļu bumbuļu parauga ņemšana un organisma noteikšana un identifikācija tajos

1. Paraugu sagatavošana:

1.1. standarta parauga lielums ir 200 bumbuļi katram testam. Intensīvākā parau­gu ņemšanā bumbuļu skaits paraugā ir lielāks, testa rezultāti var būt grūti iegūstami vai interpretējami. Tomēr šo procedūru var ērti izmantot arī paraugiem, kuros ir mazāk nekā 200 bumbuļu, ja nav pieejams nepieciešamais daudzums. Visu zemāk aprakstīto metožu validācija balstās uz 200 bumbuļu paraugu testēšanu. Zemāk aprakstīto kartupeļu ekstraktu var izmantot arī organisma noteikšanai;

1.2. papildu pirmapstrāde pirms parauga sagatavošanas:

1.2.1. paraugus pirms testēšanas izturēt 25 - 30 ⁰C temperatūrā līdz divām nedēļām, lai veicinātu visu organisma populāciju vairošanos;

1.2.2. kartupeļu bumbuļus nomazgāt. Starp katra parauga pārbaudi izmantot atbilstošus dezinfekcijas (ja veic PCR testu, izmanto hlora savienojumus, lai notīrītu iespējamo patogēna DNS) un mazgāšanas līdzekļus. Ļaut bumbuļiem nožūt. Mazgāšanas process ir īpaši lietderīgs (taču tas nav obligāts) tiem paraugiem, uz kuriem ir lieka augsnes kārta, un gadījumos, ja veic PCR testu vai tiešās izolācijas testu;

1.3. ar tīru un dezinficētu skalpeli vai dārzeņu nazi noņemt mizu pie katra bumbuļa pamatnes (stolona), lai atsegtu vadaudus. Uzmanīgi izgriezt nelielus vadaudu gabalus no stolona pamatnes un pēc iespējas censties izgriezt mazāk bumbuļa mīkstuma;

1.4. savākt stolona pamatnes vadaudu gabalus jaunos vienreizlietojamos traukos, kurus var aizvērt vai stingri noslēgt (ja izmanto vairākkārt lietojamus traukus, tos iztīra un dezinficē, izmantojot hlora savienojumus). Stolona pamatnes ieteicams apstrādāt nekavējoties. Ja tas nav iespējams, tās var uzglabāt traukā, nepievienojot buferšķīdumu ne ilgāk kā 72 stundas atvēsinātā veidā un ne vairāk kā 24 stundas istabas temperatūrā. Apstrādāt stolona pamatnes vadaudu gabalus, izmantojot vienu no turpmākajām metodēm:

1.4.1. pārliet pamatnes vadaudu gabalus ar pietiekošu daudzumu (aptuveni 40 ml) ekstrakcijas buferšķīduma (6.pielikums) un jaukt rotācijas kratītājā (50 - 100 apgr./min.) četras stundas pie temperatūras, kas zemāka par 24 ⁰C, un 16 - 24 stundas atvēsinātā veidā;

1.4.2. homogenizēt stolona pamatnes ar pietiekošu daudzumu (aptuveni 40 ml) ekstrakcijas buferšķīduma (6.pielikums) ar mikseri (Waring vai Ultra Thurax) vai sasmalcinot cieši noslēgtā vienreizlietojamā macerācijas maisiņā (piemēram, stingra polietilēna Stomacher vai Bioreba, 150 mm x 250 mm; kas sterilizēts ar jonizējošo starojumu), izmantojot gumijas āmuru vai atbilstošu smalcinātāju (piemēram, Homex);

1.5. virsējo dzidro slāni dekantēt. Ja šķidrums ir pārāk duļķains, to dzidrina, lēni centrifugējot (ne vairāk kā pie 180 g 10 min. 4 - 10 ⁰C temperatūrā) vai ar vakuumfiltrēšanu (40 - 100 µm), mazgājot filtru ar papildu (10 ml) ekstrakcijas šķīdumu;

1.6. baktēriju frakcijas koncentrēt, 15 minūtes 4 - 10 ⁰C temperatūrā centrifugējot pie 7000 gramiem (vai 10 min. pie 10000 g), un, nesamaisot nogulsnes, noliet dzidro virsējo šķidruma slāni;

1.7. atkārtoti suspendēt nogulsnes 1,5 ml ekstrakta koncentrāta buferšķīdumā (6.pielikums). Izmantot 500 µl organisma, 500 µl Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus un 500 µl references vajadzībām. Iegūstot galīgo koncentrāciju 10 - 25 % (v/v), pievienot sterilu glicerīnu 500 µl references alikvotai daļai un atlikušajai testa alikvotai, samaisīt un uzglabāt - 16 līdz - 24 ⁰C temperatūrā (nedēļas) vai - 68 līdz - 86 ⁰C (mēnešus). Testa alikvotas testēšanas laikā uzglabāt 4 - 10 ⁰C temperatūrā. Atkārtota sasaldēšana un atkausēšana nav ieteicama. Ja ekstraktu nepieciešams transportēt, nodrošina pārvadāšanu ledusskapī 24 stundu laikā;

1.8. organisma pozitīvie kontroles materiālus un paraugus obligāti apstrādā atsevišķi, lai izvairītos no inficēšanās. Tas attiecas uz IF priekšmetstikliņiem un uz visiem testiem;

2. IF tests:

2.1. izmantot daudzlodziņu priekšmetstikliņus, kuriem, vēlams, būtu 10 lodziņi vismaz sešu milimetru diametrā. Testēt kontroles materiālus tāpat kā paraugu;

2.2. sagatavot testu priekšmetstikliņus, izmantojot vienu no šādām procedūrām:

2.2.1. ekstrakta koncentrātam ar samērā nelielām cietes nogulsnēm ar pipeti pirmajā lodziņā pārnes kartupeļu ekstrakta koncentrāta 1/100 atšķaidījuma (15 µl lodziņam ar sešu milimetru diametru - lielākiem lodziņiem šo daudzumu proporcionāli palielināt). Pēc tam līdzīgu daudzumu neatšķaidīta ekstrakta koncentrāta (1/1) pārnest rindā atlikušajos lodziņos. Otro rindu var izmantot kā dublikātu vai otram paraugam;

2.2.2. pārējiem ekstrakta koncentrātiem sagatavot atkārtoti suspendētu ekstrakta koncentrātu decimālatšķaidījumus (1/10, 1/100) ekstrakta koncentrāta buferšķīdumā. Ar pipeti katrā lodziņu rindā pārnes vienādu daudzumu atkārtoti suspendētā ekstrakta koncentrāta standartdaudzumu (15 µl atbilst lodziņam ar 6 mm diametru - lielākiem lodziņiem šo daudzumu proporcionāli palielināt). Otro rindu var izmantot kā dublikātu vai otram paraugam;

2.3. pilienus nožāvēt apkārtējās vides temperatūrā vai sildot līdz 40 - 45 ⁰C. Baktēriju šūnas nofiksēt uz priekšmetstikliņa karsējot (15 minūtes 60 ⁰C temperatūrā), apdedzinot ar liesmu, izmantojot 95 % etanolu vai saskaņā ar antivielu piegādātāju īpašiem norādījumiem. Nepieciešamības gadījumā fiksētos priekšmetstikliņus pirms turpmākas testēšanas var uzglabāt sasaldētā veidā žāvēšanas kastē iespējami īsāku laika posmu (ne vairāk kā trīs mēnešus);

2.4. IF procedūra:

2.4.1. sagatavojot testa priekšmetstikliņus atbilstoši šī pielikums 2.2.1.apakšpunktam. Sagatavot divkāršu atšķaidījumu komplektu. Pirmajā lodziņā jābūt ½ titra (T/2), pārējos - ¼ titra (T/4), ½ titra (T/2), pilnam titram (T) un divkāršam titram (2T) (1.attēls);

1.attēls

 

Testa priekšmetstikliņa sagatavošana

	Atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta atšķaidījumi
	1/100	1/1	1/1	1/1	1/1	[] Atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta atšķaidījums
(T = titrs)	T/2	T/4	T/2	T	2T	[] Divkārši imūnseruma/antivielas atšķaidījumi
1. paraugs	•1	•2	•3	•4	•5
1. parauga dublikāts vai 2. paraugs	•6	•7	•8	•9	•10

 

2.4.2. sagatavojot testa priekšmetstikliņus atbilstoši šī pielikuma 2.2.2.apakšpunktam. Sagatavot antivielu darba atšķaidījumu (DA) IF buferšķīdumā (2.attēls). Darba atšķaidījums ietekmē noteikšanas specifiskumu;

2.attēls

 

Testa priekšmetstikliņa sagatavošana

	Imūnseruma/antivielas darba atšķaidījumi
	1/1	1/10	1/100	tukšs	tukšs	[] Atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta decimālatšķaidījums
1. paraugs	•1	•2	•3	•4	•5
1. parauga dublikāts vai 2. paraugs	•6	•7	•8	•9	•10

 

2.4.3. priekšmetstikliņus salikt uz mitrām papīra salvetēm. Katru testēšanas lodziņu pilnībā pārklāt ar antivielas atšķaidījumu. Antivielas tilpumam, kas uzpilināts katram lodziņam, jābūt vismaz vienādam ar ekstrakta tilpumu. Ja nav antivielu piegādātāju īpašu norādījumu, jāveic šāda procedūra:

2.4.3.1. priekšmetstikliņus iztur uz mitrām salvetēm apsegtā veidā 30 minūtes apkārtējās vides temperatūrā (18 - 25 ⁰C);

2.4.3.2. nokratīt pilienus no katra priekšmetstikliņa un rūpīgi noskalot ar IF buferšķīdumu. Skalo, uz piecām minūtēm iemērcot IF - Tween buferšķīdumā (6.pielikums) un pēc tam IF buferšķīdumā. Izvairīties no aerosolu veidošanās vai pilienu pārnešanas, kas var izraisīt sasvstarpēju inficēšanos. Uzmanīgi ņem lieko šķidrumu viegli nosusinot;

2.4.3.3. priekšmetstikliņus salikt uz mitrām papīra salvetēm. Nosegt testa lodziņus ar FITC konjugāta atšķaidījumu, ko izmantoja titra noteikšanai. Konjugāta tilpumam, kas uzklāts lodziņiem, jābūt vienādam ar izmantoto antivielu tilpumu;

2.4.3.4. priekšmetstikliņus iztur uz mitrām salvetēm apsegtā veidā 30 minūtes apkārtējās vides temperatūrā (18 - 25 ⁰C);

2.4.3.5. nokratīt konjugāta pilienus no priekšmetstikliņa. Pirms tam noskalot un nomazgāt. Rūpīgi nosusināt lieko šķidrumu;

2.4.4.7. ar pipeti katrā lodziņā pārnest 5 - 10 µl 0,1 M fosfātbuferēta glicerīna (6.pielikums) vai tirdzniecībā pieejamas krāsas noturīgumu sekmējošas saistvielas un uzlikt segstikliņu;

2.5. IF testa rezultātu nolasīšana:

2.5.1. testa priekšmetstikliņus pārbaudīt ar epifluorescences mikroskopu, izmantojot filtrus, kas piemēroti darbam ar FITC, ūdens vai eļļas imersijā 500 līdz 1000 reižu palielinājumā. Lodziņus apskatīt pa diviem diametriem, kas krustojas taisnā leņķī, un pa perimetru. Paraugiem, kuros šūnas neredz vai redzamas nelielā daudzumā, izskatīt vismaz 40 mikroskopa lauciņus;

2.5.2. pārbaudīt, vai priekšmetstikliņu testa lodziņos ir redzamas spilgtas fluorescējošas šūnas ar organisma raksturīgo morfoloģiju. Fluorescences intensitātei jābūt tādai pašai kā pozitīvajam kontroles celmam vienādā antivielu atšķaidījumā. Šūnas ar nepilnīgu iekrāsojumu vai vāju fluorescenci netiek ņemtas vērā;

2.5.3. ņem vērā tikai raksturīgā izmēra fluorescējošas šūnas ar tipisku morfoloģiju pie antivielu titra vai darba atšķaidījumā, kā noteikts šī pielikuma 2.4.apakšpunktā;

2.6. IF testa nolasījuma interpretācija:

2.6.1. ja atrastas spilgti fluorescējošas šūnas ar raksturīgo morfoloģiju, noteikt raksturīgo šūnu vidējo skaitu mikroskopa lauciņā un aprēķināt raksturīgo šūnu skaitu vienā mililitrā atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta saskaņā ar šo noteikumu 7.pielikumu. IF tests ir pozitīvs paraugiem, kuros ir ne mazāk kā 5 x 10³ tipisko šūnu vienā ml atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta. Šādu paraugu uzskata par potenciāli inficētu un ir nepieciešama turpmāka testēšana;

2.6.2. IF tests ir negatīvs paraugiem, kuros ir mazāk kā 5 x 10³ tipisko vai netipisko šūnu vienā ml atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta, un paraugu uzskata par negatīvu. Turpmāko testēšanu neveic;

3. PCR tests:

3.1. izmanto attiecīgi validētus PCR reaģentus un protokolus saskaņā ar šo noteikumu 8.pielikumu. Ieteicams izvēlēties metodi ar iekšējo kontroli.

Izmanto piemērotus piesardzības pasākumus, lai izvairītos no parauga inficēšanas ar mērķa DNS. PCR testu veic īpaši aprīkotās molekulārās bioloģijas laboratorijās, lai samazinātu iespēju inficēt paraugu ar mērķa DNS. Negatīvos kontrolparaugus (DNS ekstrakcija un PCR) vienmēr izmanto kā procedūras galīgos paraugus, lai konstatētu, vai ir notikusi DNS pārnese. PCR testā ietver šādus negatīvos kontrolparaugus:

3.1.1. ekstrakta paraugu, kas pirms tam uzrādījis negatīvu rezultātu attiecībā uz organisma klātbūtni;

3.1.2. buferšķīduma kontrolparaugi, kas izmantoti baktērijas un DNS ekstrakcijai no parauga;

3.1.3. PCR reakcijas maisījums;

3.1.4. ja iespējams, veicot PCR, izmantot arī DNS no pozitīvajiem kontrolparaugiem. Lai izvairītos no iespējamās inficēšanās, pozitīvos kontrolparaugus sagatavo atsevišķi no testējamiem parau­giem. Paraugu ekstraktus pēc iespējas attīra no augsnes. Tādēļ noteiktos gadījumos, ja paredzēts izmantot PCR protokolu, ieteicams sagatavot ekstraktus no mazgātiem kartupeļiem;

3.2. DNS attīrīšanas metodes. Mērķa DNS attīrīšanai no sarežģītiem paraugu substrātiem ir pieejamas dažādas metodes, tādējādi atdalot PCR un citu fermentatīvo reakciju inhibitorus un parauga ekstraktā koncentrējot mērķa DNS. Lietošanai kopā ar validētajām PCR metodēm, kas aprakstītas šo noteikumu 8.pielikumā, ir optimizētas šādas metode:

3.2.1. Pastrik (2000) metode:

3.2.1.1. iepilināt 220 µl lizēšanas buferšķīduma (100 mM NaCl, 10 mM Tris - HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml mikromēģenē;

3.2.1.2. pievienot 100 µl parauga ekstrakta un uz 10 minūtēm ievietot sildīšanas blokā vai ūdens vannā 95 ⁰C temperatūrā;

3.2.1.3. mēģeni 5 minūtes ievietot ledū;

3.2.1.4. pievienot 80 µl lizocīma rezerves šķīduma (50 mg lizocīma uz 1 ml 10 mM Tris HCl, pH 8,0) un 30 min. inkubēt 37 ⁰C temperatūrā;

3.2.1.5. pievienot 220 µl Easy DNA^® A šķīduma (Invitrogen), labi samaisīt un 30 min. inkubēt 65 °C temperatūrā;

3.2.1.6. pievienot 100 µl Easy DNA^® B šķīduma (Invitrogen), spēcīgi samaisīt vorteksā, līdz paraugs kļūst viendabīgi viskozs;

3.2.1.7. pievienot 500 µl hloroforma un maisīt līdz viskozitāte samazinās un maisījums kļūst viendabīgs;

3.2.1.8. centrifugēt 20 min. 4 ⁰C temperatūrā pie 15 000 g, lai atdalītu fāzes un veidotu starpfāzi;

3.2.1.9. pārliet virsējo fāzi tīrā mikromēģenē;

3.2.1.10. pievienot 1 ml 100 % etanola
(- 20 °C), samaisīt un 10 min turēt ledū;

3.2.1.11. centrifugēt 20 min. 4 ⁰C temperatūrā pie 15 000 g un atdalīt etanolu no ekstrakta koncentrāta;

3.2.1.12. pievienot 500 µl 80 % etanola
(- 20 ⁰C) un maisīt apvēršot;

3.2.1.13. centrifugēt 10 min. 4 ⁰C temperatūrā pie 15 000 g, saglabāt ekstrakta koncentrātu un atdalīt etanolu;

3.2.1.14. ļaut ekstrakta koncentrātam izžūt apkārtējā vidē vai DNS vakuumžāvētājā;

3.2.1.15. atkārtoti suspendēt ekstrakta koncentrātu 100 µl sterila ultratīra ūdens (UPW) un vismaz 20 min. atstāt istabas temperatūrā;

3.2.1.16. līdz izmantošanai PCR glabāt - 20 ⁰C temperatūrā;

3.2.1.17. centrifugējot atdalīt baltas nogulsnes, ja tādas ir, un PCR izmantot 5 µl virsējā dzidrā slāņa, kas satur DNS;

3.2.2. citas metodes. Citas DNS ekstrakcijas metodes, piemēram, Qiagen DNeasy Plant Kit, var piemērot ar nosacījumu, ka ir pierādīta to līdzvērtīga efektivitāte DNS attīrīšanā no kontrolparaugiem, kas 1 ml satur 10³ līdz 10⁴ patogēnās baktērijas.

3.3. PCR:

3.3.1. sagatavot PCR testa un kontroles testa veidnes saskaņā ar protokoliem (8.pielikums). Sagatavot vienu parauga DNS ekstrakta decimālatšķaidījumu (1:10 ultratīrā ūdenī);

3.3.2. saskaņā ar publicētajiem protokoliem sagatavot atbilstošu PCR maisījumu vidē, kurā nevar notikt inficēšanās (8.pielikums). Ja iespējams, ieteicams lietot daudzkārtējas PCR protokolu, kas ietver arī PCR iekšējo kontroli;

3.3.3. pievienot 2 - 5 µl DNS ekstrakta uz 25 µl PCR reakcijas sterilās PCR mēģenēs saskaņā ar PCR protokoliem (8.pielikums);

3.3.4. pievienot negatīvo kontrolparaugu, kas satur tikai PCR reakcijas maisījumu, un pievienot tās pašas izcelsmes ultratīru ūdeni, kāds tika izmantots PCR maisījumā parauga vietā;

3.3.5. mēģenes ievietot tajā pašā termokamerā, ko izmantoja iepriekšējai orientējošai pārbaudei, un īstenot attiecīgi optimizētu PCR programmu (8. pielikums).

3.4. PCR produkta analīze:

3.4.1. sadalīt PCR amplikonus ar agarozes gela elektroforēzi. Elektroforēzi izdara ar 5 - 8 V/cm vismaz 12 µl DNS pavairošanas reakcijas maisījuma no katra parauga, kas sajaukts ar 3 µl balasta buferšķīduma (6. papildinājums) 2,0 % (m/v) agarozes gelā tris-actetāt-EDTA (TAE) buferšķīdumā (8.pielikums). Izmantot atbilstošu DNS marķieri, piemēram, 100 bp ladder;

3.4.2. atklāt DNS joslas, 30b - 60 min. krāsojot ar etīdija bromīdu (0,5 mg/l), darbā ar šo mutagēno vielu. ievērojot atbilstošus piesardzības pasākumus;

3.4.3. krāsotajā gelā ar īsviļņu UV diafanoskopiju (piemēram, λ = 302 nm) novēro pavairotos PCR produktus, kuru izmērs atbilst paredzētajam (8.pielikums), procesu dokumentē;

3.4.4. attiecībā uz visiem jaunajiem atradumiem vai gadījumiem salīdzināt PCR amplikona autentiskumu, veicot fermentatīvu restrikcijas analīzi ar atlikušo pavairoto DNS paraugu, to optimālu laiku optimālā temperatūrā inkubējot ar atbilstošu fermentu un buferšķīdumu (8.pielikums). Identificēt fragmentus, kas sašķelti agarozes gela elektroforēzē, pēc iepriekš norādītās metodes un pēc krāsošanas ar etīdija bromīdu novērot restrikcijas fragmentu raksturīgo izvietojumu, izmantojot UV diafanoskopiju. Salīdzināt pozitīvās liecības pirms šķelšanas reakcijas un pēc tās.

3.5. PCR testa rezultātu interpretācija:

3.5.1. PCR testa rezultāts ir negatīvs, ja organismam raksturīgais paredzamā izmēra PCR amplikons attiecīgajā paraugā netiek konstatēts, bet to konstatē visos pozitīvajos kontrolparaugos (daudzkārtējas PCR gadījumā ar augiem raksturīgiem iekšējās kontroles praimeriem: otrais paredzamā izmēra PCR produkts jāpavairo ar attiecīgo paraugu);

3.5.2. PCR testa rezultāts ir pozitīvs, ja tiek konstatēts īpašais organismam paredzamā izmēra PCR amplikons ar raksturīgo izvietojumu pēc restrikcijas (vajadzības gadījumā), ar nosacījumu, ka tas nav iegūts no kāda no negatīvajiem kontrolparaugiem. Ticamu pozitīva rezultāta apstiprinājumu var iegūt arī, atkārtojot testu ar otru PCR praimeru komplektu (8.pielikums). Aizdomas par inficēšanos var rasties, ja paredzamais amplikons ir iegūts no viena vai vairākiem negatīvajiem kontrolparaugiem;

4. FISH tests:

4.1. kartupeļu ekstrakta fiksēšana:

4.1.1. sagatavot fiksējošo šķīdumu saskaņā ar šo noteikumu 9.pielikumu;

4.1.2. ar pipeti pārnes 100 µl katra ekstrakta parauga mikromēģenē un septiņas minūtes centrifugē ar 7 000 gramiem;

4.1.3. atdala augšējo dzidro slāni un ekstrakta koncentrātu izšķīdina 200 µl fiksatora, kas sagatavots < 24 stundas pirms tam. Samaisa un vienu stundu iztur ledusskapī;

4.1.4. centrifugē septiņas minūtes pie 7 000 gramiem, atdala augšējo dzidro slāni un ekstrakta koncentrātu atkārtoti suspendē 75 µl 0,01M FB (9. pielikums);

4.1.5. pārnes 16 µl fiksētās suspensijas uz tīra, daudzkārt izmantojama priekšmetstikliņa (3.attēlā). Uz katra priekšmetstikliņa pārnes divus dažādus neatšķaidītus paraugus, un izmanto 10 µl, lai sagatavotu 1:100 atšķaidījumu (0,01M PB). Atlikušo parauga šķīdumu (49 µl) var glabāt - 20 ⁰C temperatūrā, pievienojot 1 tilpuma vienību 96 % etanola. Ja FISH pārbaudei nepieciešama atkārtota procedūra, etanolu atdala centrifugējot, un pievieno tādu pašu daudzumu 0,01 PB (sajauc ar vorteksu);

3.attēls

 

FISH priekšmetstikliņa izkārtojums

1. segstikliņš	1. paraugs O 1. lodziņš	Tukšs O 2. lodziņš	Tukšs O 3. lodziņš	Tukšs O 4. lodziņš
2. segstikliņš	1. paraugs O 6. lodziņš	Tukšs O 7. lodziņš	Tukšs O 8. lodziņš	Tukšs O 9. lodziņš

 

4.1.6. ļaut priekšmetstikliņiem nožūt (vai žāvēt uz priekšmetstikliņu žāvētāja 37 ⁰C temperatūrā) un fiksēt ar liesmu. Šajā posmā procedūru var pārtraukt un hibridizāciju turpināt nākamajā dienā. Priekšmetstikliņus glabā istabas temperatūrā sausā, no putekļiem tīrā telpā;

4.2. hibridizācija:

4.2.1. šūnas dehidrēt, vienu minūti secīgi iemērcot 50 %, 80 % un 96 % etanolā. Ļaut priekšmetstikliņiem nožūt priekšmetstikliņu statīvā;

4.2.2. sagatavot mitro inkubācijas kameru, izklājot hermētiskas kastes pamatu ar salveti vai filtrpapīru, kas iemērkts 1 x hibrīdšķīdumā saskaņā ar šo noteikumu 9.pielikumu. Sagatavot kasti inkubācijai, vismaz uz 10 minūtes ievietojot hibridizācijas žāvēšanas skapī 45 ⁰C temperatūrā;

4.2.3. uzklāt 10 µl hibridizācijas šķīduma saskaņā ar šo noteikumu 9.pielikumu katra priekšmetstikliņa astoņiem lodziņiem (1., 2., 4., 5., 6., 7., 9. un 10. lodziņam), saskaņā ar 3.attēlu, divus lodziņus centrā atstājot tukšus (3. un 8.);

4.2.4. uzlikt segstikliņus (24 x 24 mm) pirmajiem un pēdējiem četriem lodziņiem, izspiežot gaisu. Novietot priekšmetstikliņus hibridizācijai iepriekš uzsildītā mitruma kamerā uz piecām stundām 45 ⁰C temperatūrā tumsā;

4.2.5. sagatavot trīs vārglāzes, kurās ir viens litrs Milli Q (molekulāras klases) ūdens, viens litrs 1 x hibridizācijas maisījuma (334 ml 3 hibridizācijas maisījuma un 666 ml Milli Q ūdens) un 1 l 1/8 x hibrīdmaisījuma (42 ml 3 x hibridizācijas maisījuma un 958 ml Milli Q ūdens). Katru no tām sagatavot inkubācijai ūdens vannā 45 °C temperatūrā;

4.2.6. no priekšmetstikliņiem noņemt segstikliņus un novietot priekšmetstikliņu statīvā;

4.2.7. noskalot lieko parauga daudzumu, 15 minūtes izturot vārglāzē ar 1 x hibridizācijas maisījuma 45 °C temperatūrā;

4.2.8. ievietot priekšmetstikliņu statīvu 1/8 hibridizācijas maisījuma mazgāšanas šķīdumā un izturēt vēl 15 minūtes;

4.2.9. uz īsu brīdi iemērkt priekšmetstikliņus Milli Q ūdenī un novietot tos uz filtrpapīra. Nosusināt lieko mitrumu, virsmu uzmanīgi pārsedzot ar filtrpapīru. Katrā lodziņā pārnest 5 - 10 µl krāsojuma noturīgumu sekmējoša histoloģiska šķīduma (piemēram, Vectashield, Vecta Laboratories, Kanāda, ASV vai līdzvērtīga šķīduma) un visu priekšmetstikliņu pārsegt ar lielo segstikliņu (24 x 60 mm).

4.3. FISH testa rezultātu nolasīšana:

4.3.1. nekavējoties izskatīt imersijas eļļā priekšmetstikliņus ar epifluorescences mikroskopu 630 vai 1000 reižu palielinājumā. Ar filtru, kas piemērots fluoresceīna izotiocianātam (FITC) eubaktēriju šūnas (tostarp izteiktākās gramnegatīvās šūnas) paraugā iekrāsojas fluorescējoši zaļā krāsā. Izmantojot tetrametilrodamīna 5-izo­tiocianāta filtru, Cy3 iekrāsotās organisma šūnas izskatās fluorescējoši sarkanas. Salīdzināt šūnu morfoloģiju ar pozitīvo kontrolparaugu morfoloģiju. Šūnām jābūt spilgti luminiscējošām un pilnībā iekrāsotām. FISH tests jāatkārto, ja krāsojumam ir novirze no normālā. Lodziņus apskatīt pa diviem diametriem, kas krustojas taisnā leņķī, un pa perimetru. Attiecībā uz paraugiem, kuri uzrāda nelielu daudzumu šūnu, izskatīt vismaz 40 mikroskopa lauciņus;

4.3.2. pārbaudīt, vai priekšmetstikliņu testa lodziņos ir redzamas spilgtas fluorescējošas šūnas ar organismam raksturīgo morfoloģiju. Fluorescences intensitātei jābūt tādai pašai kā pozitīvajam kontroles celmam vai intensīvākai. Šūnas ar nepil­nīgu iekrāsojumu vai vāju fluorescenci netiek ņemtas vērā;

4.3.3. ja ir aizdomas par inficēšanos, testu atkārto. Tas var būt gadījumā, ja visi attiecīgās partijas priekšmetstikliņi uzrāda inficētas šūnas sakarā ar buferšķīduma inficēšanu, vai ja inficētas šūnas tiek konstatētas uz segstikliņa (ārpus priekšmetstikliņa lodziņiem);

4.3.4. pastāv vairākas problēmas, kas raksturīgas FISH testam. Ekstraktos no kartupeļu stolona pamatnēm un lakstu segmentiem varētu rasties netipiskas morfoloģijas fluorescences šūnu fona populācijas un savstarpēji reaģējošas saprofītās baktērijas, kuru izmērs un morfoloģija ir līdzīgi organismi, taču tas notiek daudz retāk nekā veicot IF testu;

4.3.5. ņem vērā tikai fluorescējošas šūnas ar tipisku morfoloģiju un raksturīgo izmēru;

4.4. FISH testa rezultātu interpretācija:

4.4.1. derīgus FISH testa rezultātus iegūst, ja visos pozitīvajos kontrolparaugos, izmantojot FITC filtru, konstatē koši zaļas fluorescējošas šūnas ar organismam raksturīgo izmēru un morfoloģiju, un, izmantojot rodamīna filtru, konstatē sarkanas fluorescējošas šūnas, un tās netiek konstatētas nevienā negatīvajā kontrolparaugā. Ja ir atrastas spilgti fluorescējošas šūnas ar raksturīgo morfoloģiju, noteikt raksturīgo šūnu vidējo skaitu mikroskopa lauciņā un aprēķināt raksturīgo šūnu skaitu vienā mililitrā atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta (6.pielikums). Paraugus, kuros konstatē vairāk nekā 5 x 10³ tipisko šūnu 1 ml atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta, uzskata par potenciāli inficētiem. Nepieciešama turpmāka testēšana. Parau­gus, kuros konstatē mazāk kā 5 x 10³ tipisko šūnu 1 ml atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta, uzskata par neinficētiem;

4.4.2. FISH testa rezultāts ir negatīvs, ja, izmantojot rodamīna filtru, netiek konstatētas koši sarkanas fluorescējošas šūnas ar R. solanacearum raksturīgo izmēru un morfoloģiju, ar nosacījumu, ka raksturīgās koši sarkanās fluorescējošās šūnas konstatē pozitīvajos kontrolparaugos, izmantojot rodamīna filtru;

5. Biopatogenitātes tests:

5.1. izmantot pret slimību ieņēmīgu šķirņu tomātu 10 testējamos augus (piemēram, Moneymaker vai šķirni, kas saskaņā ar laboratorijas atzinumu ir tikpat ieņēmīga pret slimību), no kuriem visi paraugi ir trešās īstās lapas fāzē. Audzēšana saskaņā ar šo noteikumu 10.pielikumu. Alternatīvi var izmantot baklažānu augus (Black Beauty vai šķirni, kas ir tikpat ieņēmīga pret slimību), izmanto tikai augus, kuri ir 2 - 3 lapas fāzē līdz pat trešā lapa pilnībā attīstījusies. Pierādīts, ka baklažānu augos simptomi ir mazāk izteikti un attīstās lēnāk. Tādēļ, ja tas ir iespējams, ieteicams izmantot tomātu stādus;

5.2. starp testējamajiem augiem sadalīt 100 µl parauga ekstrakta:

5.2.1. inokulācija ar šļirci. Augu stublājus inokulēt uzreiz virs dīgļlapām, izmantojot šļirci ar adatu zemādas injekcijām (ne mazāku par 23 g). Sadalīt paraugu starp testējamiem augiem;

5.2.2. inokulācija ar šķēlumu. Pieturot augu ar diviem pirkstiem, uz stublāja starp dīgļlapām un pirmo lapu ar pipeti ievadīt vienu pilienu suspendēta ekstrakta koncentrāta (apmēram 5 - 10 µl). Ar sterilu skalpeli izdarīt aptuveni 1,0 cm garu diagonālu griezumu, kura dziļums ir apmēram 2/3 no stublāja diametra, griezumu sākot no ekstrakta koncentrāta piliena punkta. Cieši noslēgt griezumu ar sterilu vazelīnu no šļirces;

5.3. ar tādu pašu paņēmienu, kā pozitīvo kontrolparaugu inokulēt piecus stādus ar 48 stundas izturētu organismu biovar divus virulenta celma ūdens suspensiju, kura satur 10⁵ līdz 10⁶ šūnas vienā mililitrā, un kā negatīvo kontrolparaugu inokulēt ar ekstrakta koncentrāta buferšķīdumu. Nodalīt pozitīvo un negatīvo kontrolparaugu augus no citiem augiem, lai novērstu savstarpēju inficēšanos;

5.4. audzēt testējamos augus karantīnas apstākļos ne ilgāk kā četras nedēļas 25 - 30 °C temperatūrā un augsta relatīvā mitruma apstākļos, ik dienas aplaistot, lai novērstu ūdens izsīkšanu vai auga novīšanu ūdens trūkuma dēļ. Lai izvairītos no savstarpējas inficēšanās, pozitīvās un negatīvās kontroles augus audzē pilnībā atdalītās siltumnīcas dobēs vai audzēšanas kamerās, vai, ja nepietiek vietas, stingri nodalot to apstrādes laikus. Ja augi dažādiem paraugiem ir jāaudzē cieši blakus, atdalīt tos ar atbilstošiem aizslietņiem. Mēslojot, laistot, pārbaudot un veicot citas darbības, jāievēro piesardzība, lai neizraisītu savstarpēju inficēšanos. Ir ļoti svarīgi, lai siltumnīcās nebūtu kaitēkļu, jo tie var pārnest baktērijas no viena auga un citu. Novērot, vai neparādās vīte, epinastija, hloroze ir aizkavēšanās augšanā;

5.5. izolēt no inficētajiem augiem saskaņā ar 1.pielikuma un identificēt organisma iespējamās tīrkultūras saskaņā ar 1.pielikumu;

5.6. ja pēc trim nedēļām nav novēroti simptomi, veic IF vai PCR vai izolācijas tests, izmantojot apvienotu paraugu, kas sastāv no viena centimetra gariem stublāja posmiem, kuri no katra testa auga ņemti virs inokulācijas vietas. Ja testa rezultāts ir pozitīvs, veic atšķaidījuma uzsējumu saskaņā ar 1.pielikuma 6.5.apakšpunktu;

5.7. identificē iespējamās organisma tīrkultūras saskaņā ar 1.pielikuma 6.punktu.

5.8. Biopatogenitātes testa rezultātu interpretācija:

5.8.1. derīgus biopatogenitātes testa rezultātus iegūst, ja pozitīvo kontrolparaugu augiem konstatējot tipiskus simptomus, baktērijas var atkārtoti izolēt no šiem au­giem, un negatīvajos kontrolparaugos simptomus nekonstatē;

5.8.2. biopatogenitātes testa rezultāts ir negatīvs, ja testējamie augi nav inficēti ar organismu, ar noteikumu, ka organismu parādās pozitīvajā kontrolparaugā;

5.8.3. biopatogenitātes testa rezultāts ir pozitīvs, ja testa augi ir inficēti ar organismu.

6. Identifikācijas testi:

6.1. identificē iespējamās organisma izo­lātu tīrkultūras, izmantojot vismaz divus no minētajiem testiem, kas balstīti uz atšķirīgiem bioloģiskajiem principiem.

6.2. IF tests:

6.2.1. sagatavot suspensiju IF buferšķīdumā, kurā ir aptuveni 10⁶ šūnu vienā ml (6.pielikums);

6.2.2. sagatavot atbilstoša imūnseruma divkārša atšķaidījuma sērijas;

6.2.3. veikt IF procedūru;

6.2.4. IF testa rezultāts ir pozitīvs, ja IF kultūras titrs ir vienāds ar pozitīvā kontrolparauga titru;

6.3. PCR tests:

6.3.1. sagatavot suspensiju molekulāras tīrības klases sterilā ūdenī, kurā ir aptuveni 10⁶ šūnas vienā ml.;

6.3.2. 100 µl šūnu suspensijas slēgtās mēģenēs 4 min. termokamerā vai verdoša ūdens vannā karsēt 100 °C temperatūrā. Tad paraugus var glabāt - 16 līdz - 24 °C temperatūrā, līdz tie ir nepieciešami.

6.3.3. veikt atbilstošās PCR procedūras, lai pavairotu raksturīgos amplikonus (piemēram, Seal et.al. (1993.); Pastrik un Maiss, (2000.); Pastrik et al., (2002.); Boudazin et al., (1999.); Opina et al., (1997.), Weller et.al. (1999.).

6.3.4. organisma identifikācija ir pozitīva, ja PCR amplikoniem ir tādi paši restrikcijas fragmentu garuma polimorfismi un amplikoni ir vienādi pēc izmēra ar pozitīvā kontrolparauga celmu.

6.4. FISH tests:

6.4.1. ultratīrā ūdenī sagatavot suspensiju , kurā ir aptuveni 10⁶ šūnu vienā ml.

6.4.2. veikt FISH procedūru, kurā ir vismaz divas organismu raksturīgās oligozondes (9.pielikums).

6.4.3. FISH testa rezultāts ir pozitīvs, ja uzsējuma un pozitīvā kontrolparauga reakcijas ir vienādas.

6.5. Izolēšanas procedūra:

6.5.1. no kartupeļu bumbuļa vadaudu gredzena vai no kartupeļa, tomāta vai cita vītes skarta saimniekauga stublāja vadaudu šķiedru pavedieniem noņemt izdalījušos šķidrumu vai krāsu mainījušos audus. Suspendēt nelielā daudzumā sterila destilēta ūdens vai 50 mM fosfātbuferšķīduma (6.pielikums) un atstāt uz 10 - 15 minūtēm;

6.5.2. sagatavot suspensijas decimālatšķaidījumu sēriju;

6.5.3. 50 - 100 µl suspensijas un atšķaidījuma ieliet universālajā barotnē (NA, YPGA vai SPA; vai Kelmana tetrazola barotnē vai validētā selektīvajā barotnē (piemēram, SMSA) (5.pielikums). Uzklāt vai iztriept, izmantojot piemērotu atšķaidījuma uzsējuma metodi. Ja tas ir lietderīgi, sagatavot atsevišķas plates ar 2. bioloģiskā varianta organisma šūnu suspensijas atšķaidījumu uzsējumiem kā pozitīvo kontrolparaugus;

6.5.4. inkubēt uzsējumus 2 - 6 dienas 28 °C temperatūrā:

6.5.4.1. universālā barotnē organisma virulentie izolāti veido pērļaini baltas, plakanas, neregulāras un šķidras konsistences kolonijas, kuru centrā bieži attīstās raksturīgi spirāles veida vijumi. Organisma nevirulentās formas veido nelielas, apaļas, sviestveida konsistences kolonijas krēmbaltā krāsā.

6.5.4.2. kelmana tetrazola un SMSA barotnē spirāles veida vijumi ir asinssarkanā krāsā. Organisma nevirulentās formas veido nelielas, apaļas, sviestveida konsistences kolonijas tumši sarkanā krāsā.

7. Selektīvā izolācija:

7.1. izmantot atbilstošu atšķaidījumu uzsējumu metodi, kuras mērķis ir nodrošināt attīrīšanu no visām fona saprofītajām kolonijas veidojošajām populācijām. Uz katras plates izlīdzināt 50 - 100 ml parauga ekstrakta un atšķaidījuma;

7.2. plates inkubēt 28 °C temperatūrā. Nolasīt plates pēc 48 stundām, un pēc tam katru dienu līdz sestajai dienai. Tipiskas organisma kolonijas uz SMSA barotnes ir pienbaltas krāsas, plakanas, neregulāras un šķidras konsistences, un pēc triju dienu inkubācijas vidū attīstās sārts līdz asinssarkans iekrāsojums, iekšpusē ar svītrām vai spirālveida veidojumiem;

7.3. attīrīt iespējamās organisma kolonijas pēc uzklāšanas vai uzsējuma uz universālās barotnes, lai iegūtu izolētas kolonijas (5.pielikums);

7.4. kultūras īslaicīgi glabā sterilā ūdenī (pH 6 - 8, nesatur hloru) istabas temperatūrā tumsā, vai ilglaicīgi glabā piemērotā krioprotektanta barotnē - 68 līdz - 86 °C temperatūrā vai liofilizētas;

7.5. identificē iespējamās kultūras saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikuma 6.punktu;

7.6. Selektīvo uzsējumu testa rezultātu interpretācija:

7.6.1. selektīvo uzsējumu testa rezultāts ir negatīvs, ja pēc sešām dienām nav konstatētas baktēriju kolonijas vai nav konstatētas organisma tipiskas iespējamās kolonijas, ar nosacījumu, ka nepastāv aizdomas par to, ka citu baktēriju konkurences vai antagonisma dēļ tās ir inhibētas, un ka pozitīvajā kontrolparaugā ir atrastas organisma tipiskās kolonijas;

7.6.2. selektīvo uzsējumu tests ir pozitīvs, ja tiek izolētas iespējamās organisma kolonijas.

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
2.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.364

Organisma noteikšana un identifikācija kartupeļu, tomātu vai citos saimniekaugu paraugos

1. Paraugu sagatavošana:

1.1. ievietot 1 - 2 stublāju segmentus slēgtā sterilā traukā, ievērojot šādas parau­gu ņemšanas procedūras:

1.1.1. tomātu stādi: ar tīru, dezinficētu nazi atdalīt vienu centimetru lielu segmentu no katra stublāja pamata, pavisam nedaudz virs augsnes līmeņa;

1.1.2. laukā vai siltumnīcā audzēti tomātu augi: ar tīru, dezinficētu nazi atdalīt katra auga pašu apakšējo sānu dzinumu, nogriežot to tieši virs savienojuma ar galveno stublāju Atdalīt vienu centimetru lielu segmentu katra sānu dzinuma apakšdaļā;

1.1.3. citi saimniekaugi: ar tīru, dezinficētu nazi vai atzarošanas šķērēm atdalīt vienu centimetru lielu segmentu no katra stublāja pamata, pavisam nedaudz virs augsnes līmeņa. Attiecībā uz S. dulcamara vai citiem saimniekaugiem, kas aug ūdenī, atdalīt 1 - 2 cm lielus segmentus no zemūdens stublāja vai stolona saknēm, kas atrodas ūdenī. Ja paraugus ņem konkrētā teritorijā, ieteicams testēt statistiski reprezentatīvus paraugus no vismaz 10 augiem katrā potenciālajā nezāļu saimniekaugu paraugu ņemšanas vietā. Patogēnu visdrošāk var noteikt vēlā pavasarī, vasarā un rudenī, kaut arī dabīgās infekcijas daudzgadīgos Solanum dulcamara, kas aug ūdenstecēs, var konstatēt visu gadu. Zināmo saimniekaugu vidū ir pašizsējas kartupeļu augi, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium un citi nakteņu dzimtas augi. Vēl par saimniekaugiem uzskata Pelargonium spp. un Portulaca oleracea. Dažas nezāļu sugas Eiropā, kuru saknes vai sakneņi varētu būt vai ir potenciālie organismi divi bioloģiskā varianta/trešās rases saimnieki, noteiktos vides apstākļos ietver Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra un Urtica dioica.

1.2. neilgu laiku dezinficē stublāju segmentus ar 70 % etanolu un nekavējoties nosusina ar papīra salveti. Tad stublāja segmentus apstrādā pēc vienas no šādām metodēm:

1.2.1. apliet stublāju segmentus ar pietiekamu daudzumu (aptuveni 40 ml) ekstrakcijas buferšķīduma (6.pielikums) un jaukt kratītājā (50 - 100 apgr./min.) četras stundas pie temperatūrā zem 24 °C, vai 16 - 24 stundas atvēsinātā veidā;

1.2.2. nekavējoties homogenizēt stublāja segmentus ar pietiekamu daudzumu ekstrakcijas šķīduma (6.pielikums), sasmalcinot stingrā macerācijas maisiņā (piemēram, Stomacher vai Bioreba), izmantojot gumijas āmuru vai atbilstošu smalcinātāju (piemēram, Homex). Ja tūlītēja apstrāde nav iespējama, stublāja segmentus uzglabāt ne ilgāk kā 72 stundas atvēsinātā veidā un ne vairāk kā 24 stundas istabas temperatūrā;

1.2.3. nostādināt 15 minūtes, tad virsējo dzidro slāni dekantēt;

1.2.4. baktēriju frakcijas ekstraktu vai koncentrātu parasti nav nepieciešams turpmāk dzidrināt, bet to var izdarīt filtrējot vai centrifugējot, saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikuma 1.3., 1.4. un 1.5.punktu;

1.2.5. sadalīt neatšķaidīto vai koncentrēto paraugu ekstraktu divās vienādās daļās. Uzglabāt vienu daļu 4 - 10 °C temperatūrā testēšanas laikā un otru daļu, ja nepieciešama turpmāka testēšana, uzglabāt, izmantojot 10 - 25 % (v/v) sterilu glicerīnu, - 16 līdz - 24 °C temperatūrā (nedēļas) vai - 68 līdz - 86 °C (mēnešus);

2. Testēšana:

2.1. selektīvās izolācijas testu veic saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikuma 6.5.punktu;

2.2. biopatogenitātes testu veic saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikuma 5.punktu;

2.3. identifikācijas testu veic saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikuma 6.punktu.

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
3.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.364

Organisma noteikšana un identifikācija ūdenī

1. Paraugu sagatavošana:

1.1. izraudzītajās paraugu ņemšanas vietās ūdens paraugus ņemt, piepildot vienreizlietojamas sterilas mēģenes vai pudeles, ja iespējams, vismaz 30 cm dziļumā un vismaz divus metrus no krasta. Pārstrādes un notekūdeņu paraugus ņemt to izplūdes vietā. Ieteicamais paraugu lielums ir 500 ml no katras paraugu ņemšanas vietas. Ja ņem mazākus paraugus, katrā paraugu ņemšanas vietā ieteicams ņemt paraugus vismaz trīs reizes, katra parauga lielums ir divi atkārtoti 30 ml apakšparaugi. Intensīvai apsekošanai izvēlas vismaz trīs paraugu ņemšanas vietas uz katriem ūdensteces trīs kilometriem un nodrošina, ka paraugus ņem no pietekām, kas ieplūst ūdenstecē;

1.2. paraugus pārvadā vēsos un tumšos apstākļos (4 - 10 °C temperatūrā) un testē 24 stundu laikā;

1.3. ja nepieciešams, baktēriju frakciju var koncentrēt, izmantojot vienu no šādām metodēm:

1.3.1. 30 - 50 ml apakšparaugus centrifugēt 10 minūtes pie 10 000 gramiem (15 minūte vai pie 7 000 gramiem), vēlams, 4 - 10° C temperatūrā, noliet centrifugātu un atkārtoti suspendēt nogulsnes vienu ml nogulšņu buferšķīduma (6.pielikums);

1.3.2. veikt membrānfiltrēšanu (minimālais poru izmērs 0,45 µm), pēc tam filtru skalot ar 5 - 10 ml nogulšņu buferšķīduma un mazgāšanas šķīdumus saglabāt. Šī metode piemērota lielākiem ūdens tilpumiem, kas satur saprofītus nelielā daudzumā. Parasti kartupeļu pārstrādes un notekūdeņu izplūžu paraugiem veikt koncentrēšanu nav ieteicams, jo konkurējošo saprofīto baktēriju populācijas palielināšanās traucēs organisma noteikšanu.

2. testēšana:

2.1. selektīvās izolācijas testu veic saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikuma 6.5.punktu;

2.2. identifikācijas testu veic saskaņā ar 1.pielikuma 6.punktu;

2.3. biopatogenitātes testu veic saskaņā ar 1.pielikuma 5.punktu.

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
4.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.364

Organisma noteikšana un identifikācija augsnē

1. Paraugu sagatavošana:

1.1. tīruma augsnes paraugus ņem pēc tiem pašiem standarta principiem kā paraugu ņemšana nematodes noteikšanai. Katram paraugam ņem 0,5 - 1 kg augsnes no 60 vietām 0,3 hektāru platībā, ņemot augsni aptuveni 10 - 20 cm dziļumā (vai 7 x 7 m lielā kvadrātā). Ja ir aizdomas par patogēna klātbūtni, palielina paraugu ņemšanas vietu skaitu līdz 120 vietām uz 0,3 ha. Līdz testēšanai paraugus glabā 12 - 15 °C temperatūrā. No kartupeļu pārstrādes atkritumiem un notekūdeņu nosēdumiem paraugus ņem, kopā savācot vienu kilogramu no vietām, kas ir testēšanai paredzētajam kopējam nosēdumu apjomam reprezentatīvs. Katru paraugu pirms testēšanas sajauc;

1.2. izmantojot rotācijas kratītāju (250 apgr./min.), disperģēt 10 - 25 g lielus augsnes vai nosēdumu apakšparaugus 60 - 150 ml ekstrakcijas buferšķīdumā (6.pielikums) ilgākais divu stundu laikā. Ja nepieciešams, disperģēšanas veicināšanai maisīšanas laikā var pievienot 0,02 % sterila Tween-20 un 10 - 20 gramus sterilas grants;

1.3. testēšanas laikā suspensiju glabāt 4 °C temperatūrā.

2. Testēšana:

2.1. selektīvās izolācijas testu veic saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikuma 6.5.punktu;

2.2. identifikācijas testu veic saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikuma 6.punktu;

2.3. biopatogenitātes testu veic saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikuma 5.punktu.

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
5.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.364

Barotnes organisma izolācijai un audzēšanai

1. Vispārējas augšanas barotnes:

Barojošais agars (NA)
Barojošais agars (Difco)	23,0 g
Destilēts ūdens	1,0 l
Izšķīdināt sastāvdaļas un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.
Rauga peptona glikozes agars (YPGA)
Rauga ekstrakts (Difco)	5,0 g
Baktopeptons (Difco)	5,0 g
D (+) glikoze (monohidrāts)	10,0 g
Baktoagars (Difco)	15,0 g
Destilēts ūdens	1,0 l
Izšķīdināt sastāvdaļas un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.
Saharozes peptona agars (SPA)
Saharoze	20,0 g
Baktopeptons (Difco)	5,0 g
K2HPO4	0,5 g
MgSO4.7H2O	0,25 g
Baktoagars (Difco)	5,0 g
Destilēts ūdens	1,0 l
pH 7,2 - 7,4
Izšķīdināt sastāvdaļas un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.
Kelmana tetrazola barotne
Kazamīnskābes (Difco)	1,0 g
Baktopeptons (Difco)	10,0 g
Dekstroze	5,0 g
Baktoagars (Difco)	10,0 g
Destilēts ūdens	1,0 l

Izšķīdināt sastāvdaļas un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.

Atdzesēt līdz 50 °C un pievienot ar filtrāciju sterilizētu 2,3,5-trifeniltetrazola hlorīda (Sigma) šķīdumu, iegūstot galīgo koncentrāciju 50 mg/l.

2. Validētas selektīvās augšanas barotnes:

2.1. SMSA barotne (Englebrecht, 1994., atbilstoši Elphinstone et al., 1996.gada grozījumi)

Bazālā barotne

Kazamīnskābes (Difco) 1,0 g

Baktopeptons (Difco) 10,0 g

Glicerīns 5,0 ml

Baktoagars (Difco); 15,0 g

Destilēts ūdens 1,0 l

2.2. Izšķīdināt sastāvdaļas un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā. Atdzesēt līdz 50 °C un pievienot ar filtrāciju sterilizētu turpmāk minēto sastāvdaļu rezerves šķīdumu ūdenī, lai iegūtu norādītās galīgās koncentrācijas:

Kristālvioletais (Sigma) 5 mg uz l

Polimiksīna-B-sulfāts (Sigma P-1004) 600 000 U (apmēram 100 mg) / l

Bacitracīns (Sigma B-0125) 1250 U (apmēram 25 mg) / l

Hloramfenikols (Sigma C-3175) 5 mg / l

Penicilīns-G (Sigma P-3032) 825 U (apmēram 0,5 mg) / l

2,3,5-trifeniltetrazola hlorīds (Sigma) 50 mg / l

2.3. Barotņu un antibiotiku rezerves šķīdumus glabā tumsā 4 °C temperatūrā, tie jāizlieto viena mēneša laikā.

2.4. Pirms izmantošanas uz platēm nedrīkst būt virsmas kondensāta.

2.5. Nedrīkst pieļaut pārmērīgu plates izžūšanu.

2.6. Pēc katras jaunas barotņu partijas sagatavošanas veic kvalitātes kontroli, uzsējot R. solanacearum references kultūras suspensiju un novērojot, vai pēc 2-5 dienu inkubācijas 28 °C temperatūrā veidojas tipiskas kolonijas.

3. Validēta bagātināšanas barotne:

SMSA barotne (Elphinstone et al., 1996.)

Sagatavo tāpat kā SMSA selektīvo agara barotni, bet nepievieno baktoagaru un 2,3,5-tetrazola hlorīdu.

Modificēta Wilbrink barotne (Caruso et al., 2002)

Saharoze 10 g

Proteāzes peptons 5 g

K₂HPO₄ 0,5 g

MgSO₄ 0,25 g

NaNO₃ 0,25 g

Destilēts ūdens 1 l

Sterilizēt 15 minūtes autoklāvā 121 °C temperatūrā un atdzesēt līdz 50 °C. Pievieno antibiotiku rezerves šķīdumus tāpat kā SMSA barotnei.

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
6.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.364

Buferšķīdumi testu procedūrām

1. Buferšķīdumi ekstrakcijas procedūrai:

1.1. Ekstrakcijas buferšķīdums (50 mM fosfāta buferšķīdumus, pH 7,0). Šo buferšķīdumu izmanto baktēriju ekstrakcijai no augu audiem ar homogenizācijas vai kratīšanas metodi.

Na₂HPO₄ (bez ūdens) 4,26 g

KH₂PO₄ 2,72 g

Destilēts ūdens 1,00 l

Izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.

Papildu komponentus var lietot šāda veidā:

	Mērķis	Daudzums (uz l)
Lubrola pārslas	Deflokulants*	0,5 g
DC silikona pretputu līdzeklis	Pretputošanas līdzeklis*	1,0 ml
Tetranātrija pirofosfāts	Antioksidants	1,0 g
Polivinil pirolidons 4000 (PVP-40)	Saistošs PCR inhibitoriem	50 g

^*Izmantošanai ar homogenizācijas ekstrakcijas metodi.

1.2. Nogulšņu buferšķīdums (10 mM fosfāta buferšķīdums, pH 7,2). Šo buferšķīdumu izmanto kartupeļu bumbuļu stolona pamatu ekstrakta atkārtotai suspendēšanai un atšķaidīšanai pēc tā koncentrēšanas ar centrifugēšanas metodi.

Na₂HPO₄.12H₂O 2,7 g

NaH₂PO₄.2H₂O 0,4 g

Destilēts ūdens 1,0 l

Izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.

2. IF testa buferšķīdumi:

2.1. IF buferšķīdums (10 mM fosfātbuferēts nātrija hlorīda fizioloģiskais šķīdums, (PBS) pH 7,2) Šo buferšķīdumu izmanto antivielu atšķaidīšanai.

Na₂HPO₄.12H₂O 2,7 g

NaH₂PO₄.2H₂O 0,4 g

NaCl 8,0 g

Destilēts ūdens 1,0 l

Izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un 15 minūtes sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā;

2.2. IF-Tween buferšķīdums. Šo buferšķīdumu izmanto priekšmetstikliņu skalošanai. Pievienot IF buferšķīdumam 0,1 % Tween 20;

2.3. fosfātbuferēts glicerīns, pH 7,6. Šo buferšķīdumu izmanto kā histoloģisko šķīdumu IF priekšmetstikliņa lodziņos fluorescences veicināšanai:

Na2HPO4.12H2O	3,2 g
NaH2PO4.2H2O	0,15 g
Glicerīns	50 ml
Destilēts ūdens	100 ml

Krāsojuma noturīgumu sekmējoši histoloģiskie šķīdumi ir pieejami arī tirdzniecībā, piemēram, Vectashield® (Vector Laboratories) vai Citifluor® (Leica).

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
7.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.364

Inficēšanās līmeņa noteikšana ar IF un FISH testiem

1. Saskaitīt raksturīgi fluorescējošo šūnu vidējo skaitu vienā redzeslaukā (c);

2. Aprēķināt raksturīgi fluorescējošo šūnu skaitu vienā mikroskopa lodziņā (C):

C = c x S/s, kur

S = daudzlogu priekšmetstikliņa viena lodziņa virsmas laukums

s = objektīva lauka virsmas platība

s = πi²/4G²K², kur

i = lauka koeficients (atkarībā no okulāra tipa tas var būt robežās no 8 līdz 24)

K = mēģenes koeficients (1 vai 1,25),

G = objektīva palielinājums (100 x, 40 x).

3. Aprēķināt raksturīgi fluorescējošo šūnu skaitu vienā mililitrā atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta (N):

N = C x 1000/y x F, kur

y = atkārtoti suspendētā ekstrakta koncentrāta daudzums katrā lodziņā

F = atkārtoti suspendētā ekstrakta koncentrāta atšķaidījuma pakāpe

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
8.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.364

Validēts PCR protokols un reaģenti

1. Seal et al. PCR protokols (1993):

1.1. Olionukleotīda praimeri:

Augšupejošais praimers OLI - 1 5'- GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC - 3'

Apgrieztais praimers Y - 2 5'- CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT - 3'

No organisma DNS matricas sagaidāmā amplikona izmērs = 288 bp

1.2. PCR reakcijas maisījums:

Reaģents	Reakcijas daudzums	Galīgā koncentrācija
Sterils ultratīrs ūdens	17,65 µl
10 x buferšķīdums1 (15 mM MgCl2)	2,5 µl	1 x (1,5 mM MgCl2)
dNTP maisījums (20mM)	0,25 µl	0,2 mM
OLI-1 praimers (20 µM)	1,25 µl	1 µM
Y-2 praimers (20 µM)	1,25 µl	1 µM
Taq polimerāze (5U/µl ) 1	0,1 µl	0,5 U
Parauga tilpums	2,0 µl
Kopējais tilpums:	25 µl

(¹) Metode validēta, izmantojot Taq polimerāzi no Perkin Elmer (AmpliTaq) un Gibco BRL;

1.3. PCR reakcijas apstākļi:

1.3.1. veikt šādu programmu:

1.3.1.1. 1 ciklu: 2 minūtes 96 °C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana);

1.3.1.2. 35 ciklus: 20 sekundes 94 °C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana);

1.3.1.3. 20 sekundes 68 °C temperatūrā (praimeru rūdīšana);

1.3.1.4. 30 minūtes 72 °C temperatūrā (atkārtojumu paplašināšana);

1.3.1.5. 1 ciklu: 10 minūtes 72 °C temperatūrā (galīgā paplašināšana);

1.3.1.5. turēt 4 °C temperatūrā.

1.4. amplikona restriktāzes analīze. PCR produkti, kas pavairoti no organisma DNS, veido atšķirīgu restrikcijas fragmentu garuma polimorfismu ar fermentu Ava II pēc inkubācijas 37 °C temperatūrā;

2. Pastrik un Maiss (2000) PCR protokols:

2.1. Olionukleotīda praimeri:

Augšupejošais praimers Ps - 1 5'- agt cga acg gca gcg ggg g - 3'

Apgrieztais praimers Ps - 2 5' - ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca - 3'

No organisma DNS matricas sagaidāmā amplikona izmērs = 553 bp

2.2. PCR reakcijas maisījums

Reaģents	Reakcijas daudzums	Galīgā koncentrācija
Sterils ultratīrs ūdens	16,025 µl
10XPCRbuferšķīdums	2,5 µl	1 x (1,5 mM MgCl2)
BSA (V frakcija) (10%)	0,25 µl	0,1%
d-nTP maisījums (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Ps-1 praimers (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Ps-2 praimers (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Taq polimerāze (5U/µl ) 1	0,1 µl	0,5 U
Parauga tilpums	5,0 µl
Kopējais tilpums:	25,0 µl

2.3. PCR reakcijas apstākļi

2.3.1. veikt šādu programmu:

2.3.1.1. 1 ciklu: 5 minūtes 95 °C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana);

2.3.1.2. 35 ciklus: 30 sekundes 95 °C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana);

2.3.1.3. 30 sekundes 68 °C temperatūrā (praimeru rūdīšana);

2.3.1.4. 45 minūtes 72 °C temperatūrā (atkārtojumu paplašināšana);

2.3.1.5. 1 ciklu: 5 minūtes 72 °C temperatūrā (galīgā paplašināšana);

2.3.1.6. turēt 4 °C temperatūrā.

2.4. Amplikona restriktāzes analīze:

PCR produkti, kas pavairoti no organisma DNS, veido atšķirīgu restrikcijas fragmentu garuma polimorfismu ar fermentu Taq I pēc 30 minūtēm inkubācijas 65 °C temperatūrā. No organisma iegūto restrikcijas fragmentu raksturīgais izmērs ir 457 bp un 96 bp;

3. Daudzkārtējas PCR protokols ar PCR iekšējo kontroli (Pastrik et al., 2002.).

3.1. Oligonukleotīda praimeri

Augšupejošais praimers RS - 1 - F 5'- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA - 3'

Apgrieztais praimers RS - 1 - R 5'- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T - 3'

Augšupejošais praimers NS - 5 - F 5'- AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G - 3'

Apgrieztais praimers NS-6-R 5'- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC - 3'

No organisma DNS matricas sagaidāmā amplikona izmērs = 718 bp (RS praimeru komplekts).

No 18S rRNA PCR sagaidāmā iekšējās kontroles amplikona izmērs = 310 bp (NS praimeru komplekts)

3.2. PCR reakcijas maisījums:

Reaģents	Reaģenta daudzums	Galīgā koncentrācija
Sterils ultratīrs ūdens	12,625 ul
10 x PCR buferšķīdums (1) (15 mM MgCl2)	2,5 ul	1 x (1,5 mM MgCl2)
BSA (V frakcija) (10%)	0,25 ul	0,1 %
d-nTP maisījums (20 mM)	0,125 ul	0,1 mM
Praimers RS-1-F (10 uM)	2,0 ul	0,8 uM
Praimers RS-1-R (10 uM)	2,0 ul	0,8 uM
Praimers NS-5-F (10 uM) (2)	0,15 ul	0,06 uM
Praimers NS-6-R (10 uM) (2)	0,15 ul	0,06 uM
Taq polimerāze (5 U/ul) (1)	0,2 ul	1,0 U
Parauga tilpums	5,0 ul
Kopējais tilpums	25,0 ul

(1) Metodes validētas, izmantojot Taq polimerāzi no Perkin Elmer (AmpliTaq) un Gibco BRL;

3.3. NS-5-F un NS-6-R praimeru koncentrācija kartupeļu stolona pamatņu ekstrakcijai optimizēta, izmantojot homogenizācijasmetodi un DNS attīrīšanu ar Pastrik (2000) metodi;

3.4. Reaģentu koncentrācijas atkārtota optimizācija ir nepieciešama, ja izmanto ekstrakciju ar kratīšanas metodi vai citu DNS izolācijas metodi;

3.5. PCR reakcijas apstākļi:

3.5.1. veikt šādu programmu:

3.5.1.1. 1 ciklu: 5 minūtes 95 °C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana);

3.5.1.2. 35 ciklus: 30 sekundes 95 °C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana);

3.5.1.3. 30 sekundes 58 °C temperatūrā (praimeru rūdīšana);

3.5.1.4. 45 minūtes 72 °C temperatūrā (atkārtojumu paplašināšana);

3.5.1.5. 1 ciklu: 5 minūtes 72 °C temperatūrā (galīgā paplašināšana);

3.6. turēt 4 °C temperatūrā;

3.7. Amplikona restriktāzes analīze.

3.8. PCR produkti, kas pavairoti no organisma DNS, veido atšķirīgu restrikcijas fragmentu garuma polimorfismu ar fermentu Bsm I vai Isoschizomere (piemēram, Mva 1269 I) pēc 30 minūtes ilgas inkubācijas 65 °C temperatūrā.

4. Papildinājuma buferšķīduma pagatavošana:

4.1. Bromfenolzilais (10 % rezerves šķīdums)

Bromfenolzilais 5 g

Bidestilēts ūdens 50 ml

4.2. Papildinājuma buferšķīdums

Glicerīns (86 %) 3,5 ml

Bromfenolzilais 300 g

Bidestilēts ūdens 6,2 ml

4.3. 10 x tris-acetāt - EDTA (TAE) buferšķīdums, pH 8,0:

Tris buferšķīdums 48,40 g

Ledus etiķskābe 11,42 ml

EDTA (dinātrija sāls) 3,72 g

Destilēts ūdens 1,00 l

Pirms lietošanas atšķaidīt līdz 1 x.

Pieejams arī tirdzniecībā (piemēram, Invitrogen vai līdzvērtīgs).

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
9.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.364

Validētie reaģenti FISH testam

1. Oligozondes:

Organisma specifiskā oligozonde OLI - 1 - CY3: 5' - ggc agg tag caa gct acc ccc - 3'

Nespecifisko eubaktēriju zonde EUR - 338 - FITC: 5'- gct gcc tcc cgt agg agt - 3'

2. Fiksējošais šķīdums:

2.1. uzkarsēt 9 ml molekulārās klases ūdens (piemēram, ultratīru ūdeni (UPW)) līdz aptuveni 60 °C un pievienot 0,4 g paraformaldehīda. Paraformaldehīds izšķīst pēc tam, kad tam pievieno 5 pilienus 1 NNaOH, maisot ar magnētisko maisītāju;

2.2. noregulēt pH līdz 7,0, pievienojot 0,1M fosfāta buferšķīduma (PB, pH 7,0) un 5 pilienus 1 NHCl. Pārbaudīt pH ar indikatorpapīru un, ja nepieciešams, koriģēt ar HCl vai NaOH;

2.3. filtrēt šķīdumu caur 0,22 µm membrānfiltru un sargāt no putekļiem, turēt 4 °C temperatūrā līdz turpmākai izmantošanai;

3. 3 x hibridizācijas maisījums:

NaCl 2,7 M

Tris-HCl 60 Mm (Ph 7,4)

EDTA (sterilizēts ar filtrēšanu un autoklāvēts) 15 Mm

Ja nepieciešams, atšķaidīt līdz 1 x.

4. Hibridizācijas šķīdums:

1 x hibridizācijas maisījums

Nātrija dodecilsulfāts (SDS) 0,01 %

Formamīds 30 %,

zonde EUB 338 5 ng/µl

zonde OLI-1 vai OLI-2 5 ng/µl

Sagatavot hibridizācijas šķīduma daudzumus saskaņā ar 1.tabulu. Katram priekšmetstikliņam (kas satur 2 dažādus paraugus un to dublikātus) nepieciešami 90 µl hibridizācijas šķīduma.

1.tabula

 

Ieteicamie daudzumi hibridizācijas maisījuma pagatavošanai

Priekšmetstikliņu skaits:	1	4	6	8	10
Sterils ultratīrs ūdens	23,1	92,4	138,6	184,8	231,0
3 x hibridizācijas maisījums	30,0	120,0	180,0	240,0	300,0
1 % SDS	0,9	3,6	5,4	7,2	9,0
Formamīds	27,0	108,0	162,0	216,0	270,0
Zonde EUB 338 (100 ng/µl)	4,5	18,0	27,0	36,0	45,0
Zonde OLI-1 vai OLI-2 (100 ng/µl)	4,5	18,0	27,0	36,0	45,0
Kopējais tilpums (µl)	90,0	360,0	540,0	720,0	900,0

Izmantošanas laikā sargāt no tiešas sau­les vai elektriskās gaismas.

5. 0,1 M fosfāta buferšķīdums, pH 7,0:

Na₂HPO₄ 8,52 g

KH₂PO₄ 5,44 g

Destilēts ūdens 1,00 l

Izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un sterilizēt 15 min. autoklāvā 121 °C temperatūrā.

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
10.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.364

Tomātu un baklažānu augu kultūra

1. Iesēt tomātu (Lycopersicon esculentum) vai baklažānu (Solanum melongena) sēklas pasterizētā kompostā. Stādus ar pilnībā attīstītām dīgļlapām (pēc 10 - 14 dienām) pārstādīt pasterizētā kompostā podos;

2. Baklažāna vai tomātu augus pirms inokulācijas audzē siltumnīcā ar šādiem vides apstākļiem:

dienas ilgums:	14 stundas vai dabīgs dienas ilgums, ja ilgāks;
temperatūra:	dienā: 21 līdz 24 °C;
	naktī: 14 līdz 18 °C.

Ieņēmīga tomātu augu šķirne: "Moneymaker"

Ieņēmīga baklažānu šķirne: "Black Beauty".

Zemkopības ministrs M.Roze