I. Vispārīgie jautājumi

1. Noteikumi nosaka kārtību, kādā tiek apkarota kartupeļu gaišā gredzenpuve un ierobežota tās izplatība.

2. Kartupeļu gaišo gredzenpuvi ierosina augu karantīnas organisms Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (turpmāk - organisms).

3. Lai konstatētu kartupeļu gaišo gredzenpuvi, Valsts augu aizsardzības dienests (turpmāk - dienests):

3.1. regulāri pārbauda kartupeļu Solanum tuberosum L. bumbuļus un augus;

3.2. ņem sēklas kartupeļu un citai izmantošanai paredzēto kartupeļu Solanum tuberosum L. bumbuļu un augu paraugus uzglabāšanas vietās un nosūta laboratoriskām analīzēm;

3.3. pārbauda kartupeļu Solanum tuberosum L. paraugus vizuāli, pārgriežot bumbuļus. Ja tiek konstatētas kartupeļu gaišās gredzenpuves vizuālās pazīmes, ņem kartupeļu paraugus un nosūta laboratoriskai testēšanai;

3.4. saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikumā minētajām laboratoriskajām metodēm diagnosticē organismu;

3.5. organisma izolācijai un audzēšanai izmanto šo noteikumu 2.pielikumā minētās barotnes;

3.6. laboratoriskajām analīzēm izmanto šo noteikumu 3.pielikumā minētos buferšķīdumus;

3.7. organisma infekciju konstatē saskaņā ar šo noteikumu 4.pielikumu;

3.8. laboratoriskās analīzes veic saskaņā ar šo noteikumu 5., 6. un 7.pielikumu;

3.9. piemēro un kontrolē kartupeļu gaišās gredzenpuves izplatības ierobežošanas un apkarošanas pasākumus (turpmāk - fitosanitārais pasākums).

4. Personas nedrīkst uzglabāt vai pavairot organisma tīrkultūru, izņemot normatīvajos aktos par izmēģinājumiem vai zinātniskiem mērķiem un šķirņu selekcijai paredzēto kaitīgo organismu, augu, augu produktu un ar tiem saskarē nonākušo priekšmetu ievešanu un pārvietošanu minētos gadījumus.

5. Lai ierobežotu kartupeļu gaišās gredzenpuves izplatību, persona, kura audzē kartupeļus, katru gadu atjauno sēklas kartupeļus ar sertificētiem sēklas kartupeļiem 25 % apmērā no apstādāmās platības.

6. Persona, kura audzē kartupeļus, glabā dokumentus, kas apliecina sertificētu sēklas kartupeļu iegādi.

II. Fitosanitāro pasākumu noteikšana

7. Ja kartupeļu Solanum tuberosum L. pārbaudē dienests konstatē kartupeļu gaišās gredzenpuves vizuālās pazīmes vai saskaņā ar šo noteikumu 1.pielikumā minēto imunofluorescences (IF) testu (turpmāk - IF tests) iegūts pirmais pozitīvais testēšanas rezultāts, dienests pieņem lēmumu par šādu fitosanitāro pasākumu piemērošanu:

7.1. aizliedz pārvietot no saimniecības un stādīt saimniecībā tās partijas vai kravas kartupeļus, no kuras tika ņemts paraugs, līdz tiek pabeigti visi nepieciešamie šajos noteikumos minētie laboratoriskie testi. Ja nav organisma izplatīšanās riska, persona dienesta uzraudzībā veic tikai šo noteikumu 14.2.1., 14.2.2. un 14.2.3.apakš­punktā minētos pasākumus;

7.2. aizliedz personai pārvietot no saimniecības citus nakteņu dzimtas (Solanaceae) augus (turpmāk - saimniekaugs);

7.3. veic pasākumus, lai noskaidrotu organisma rašanās iespējamo cēloni.

8. Ja, turpmāk veicot šo noteikumu 1.pielikumā minētos laboratoriskos testus, organisms paraugā netiek konstatēts, dienests atceļ noteiktos fitosanitāros pasākumus.

9. Lai noteiktu organisma izcelšanās vietu, dienests pārbauda kartupeļu partijas, kas bijušas saistītas ar šo noteikumu 7.punktā minētajiem kartupeļiem.

10. Dienests apstiprina kartupeļu gaišo gredzenpuvi, ja organisms tiek konstatēts vismaz divos dažādos šo noteikumu 1.pielikumā minētajos laboratoriskajos testos.

11. Ja konstatēts organisms, dienests pieņem lēmumu par fitosanitāro pasākumu piemērošanu saskaņā ar šo noteikumu 12., 13., 14. un 15.punktu.

12. Lai noteiktu infekcijas izplatību un zemesgabala plānā atzīmētu inficēto zonu (lauku, audzēšanas vietu un saimniecības, kas jebkādā veidā ir saistītas ar inficētajiem kartupeļiem), par inficētiem nosaka:

12.1. kartupeļu Solanum tuberosum L. bumbuļu vai to augu kravu vai partiju, no kuras ņemts paraugs (turpmāk - inficētie kartupeļi);

12.2. noliktavu vai tās daļu, lauksaimniecības tehniku un transporta līdzekli, kas bijis saskarē ar inficētajiem kartupeļiem;

12.3. citus priekšmetus, ieskaitot iepakojumu, kas bijuši saskarē ar inficētajiem kartupeļiem;

12.4. lauku un audzēšanas vietu, no kuras iegūta inficēto kartupeļu raža;

12.5. lauku un audzēšanas vietu, kur kartupeļu veģetācijas periodā ņemti kartupeļu paraugi.

13. Lai noteiktu infekcijas izplatību un atzīmētu zemesgabala plānā inficēto zonu, par iespējami inficētiem nosaka:

13.1. visus kartupeļu bumbuļus vai to au­gus, ko audzē vai kas atrodas inficētajā zonā;

13.2. zemesgabalus, audzēšanas vietas un telpas, kas saistītas ar kartupeļu bumbuļiem vai augiem, kuri noteikti par inficētiem, ieskaitot audzēšanas vietas, kas lauksaimniecības tehniku, transportlīdzekļus un telpas izmanto kopīgi ar audzēšanas vietu, kurā ir konstatēti inficētie kartupeļi;

13.3. kartupeļu bumbuļus un to augus, kuri izaudzēti šo noteikumu 13.2.apakšpunktā minētajās vietās vai atradušies tajās infekcijas noteikšanas laikā;

13.4. ražošanas vietas vai telpas, kurās veic darbības ar kartupeļiem, kuri pārvietoti no šo noteikumu 13.1. un 13.2.apakšpunktā minētajām vietām vai telpām;

13.5. iekārtas, lauksaimniecības tehniku, transportlīdzekļus, noliktavas un citus priekšmetus, ieskaitot iepakojumu, kas iepriekšējo 12 mēnešu laikā varēja nonākt saskarē ar inficētajiem kartupeļiem;

13.6. kartupeļu bumbuļus vai to augus, kas bijuši saskarē ar noliktavām vai citiem priekšmetiem pirms to tīrīšanas un dezinfekcijas;

13.7. kartupeļu bumbuļus vai to augus, kuri ir saistīti ar inficētās sēklas kartupeļu partijas izcelsmi vai iegūti vienā vietā ar inficētajiem kartupeļiem, jo iespējama infekcijas izplatība, augus pavairojot;

13.8. šo noteikumu 13.7.apakšpunktā minētās audzēšanas vietas.

14. Dienests nosaka šādus fitosanitāros pasākumus:

14.1. aizliedz stādīt inficētos un iespējami inficētos kartupeļus;

14.2. uzdod veikt vienu no šādiem pasākumiem:

14.2.1. dienesta uzraudzībā iznīcināt inficētos kartupeļus;

14.2.2. rūpnieciski pārstrādāt inficētos kartupeļus, nekavējoties nogādājot tos tieši pārstrādes uzņēmumā, kuram ir piemērotas atkritumu iznīcināšanas iekārtas, noliktavas un izbraucošo transportlīdzekļu dezinficēšanas iekārtas. Šo prasību piemēro, ja pārstrādes uzņēmums piekrīt pārstrādāt inficētos kartupeļus;

14.2.3. pēc termiskās apstrādes, kas iznīcina organismu, inficētos kartupeļus izlietot lopbarībai;

14.2.4. inficētos kartupeļus nogādāt uz atkritumu iznīcināšanas vietu, kur nav riska, ka patogēns varētu nokļūt vidē;

14.2.5. sadedzināt inficētos kartupeļus;

14.2.6. iznīcināt inficēto kartupeļu atkritumus un cietos atkritumus, kas saistīti ar inficētajiem kartupeļiem, atkritumu iznīcināšanas vietā, kur nav riska, ka organisms varētu nokļūt vidē, vai sadedzināt, vai veikt citus fitosanitāros pasākumus, ja ir novērsts organisma izplatīšanās risks;

14.2.7. dienesta uzraudzībā iznīcināt ar inficētajiem kartupeļiem saistītos šķidros atkritumus;

14.2.8. dienesta uzraudzībā izlietot iespējami inficētos kartupeļus citiem mērķiem (piemēram, pārtikā vai nosūtīt pārdošanai tieši tirdzniecības vietās). Kartupeļu bumbuļus tirdzniecības vietā nogādā iepakotus, un tos nedrīkst pārpakot. Stādīšanai paredzētos kartupeļus drīkst pakot tikai pēc fasēšanas vietas iztīrīšanas un dezinfekcijas;

14.2.9. dienesta uzraudzībā iznīcināt iespējami inficētos lakstus;

14.2.10. rūpnieciski pārstrādāt iespējami inficētos kartupeļus, nekavējoties nogādājot tos iesaiņotā veidā tieši pārstrādes uzņēmumā, kuram ir piemērotas atkritumu iznīcināšanas iekārtas un kur iespējama izbraucošā transportlīdzekļa dezinfekcija.

15. Dienests kartupeļu audzētājam uzdod audzēšanas vietās, kas noteiktas par inficētām, izvēlēties un veikt vienu no šādiem fitosanitārajiem pasākumiem:

15.1. laukos, kas noteikti par inficētiem, atbilstoši lauka izmantošanas intensitātei piemēro vienu no šādiem fitosanitārajiem pasākumiem:

15.1.1. ja fitosanitāro pasākumu piemēro četrus gadus pēc infekcijas konstatēšanas:

15.1.1.1. minētajā laikposmā iznīcināt pārziemojušos kartupeļus un citus organisma saimniekaugus;

15.1.1.2. nākamos trīs gadus pēc infekcijas konstatēšanas nedrīkst stādīt kartupeļu bumbuļus, to augus, sēt to sēklas, kā arī audzēt bietes un citus organisma saim­niekaugus, līdz laukā nav pārziemojušu kartupeļu vismaz divus nākamos veģetācijas periodus;

15.1.1.3. ceturtajā gadā drīkst stādīt kartupeļus, lai iegūtu tos pārtikai, pārstrādei vai lopbarībai, ja vismaz divos iepriekšējos veģetācijas periodos pirms stādīšanas nav atrasti pārziemojuši kartupeļi un saimniekaugi. Ceturtajā gadā iestādītos kartupeļus pēc ražas novākšanas pārbauda atbilstoši šo noteikumu 3.punktam;

15.1.1.4. kārtējā kartupeļu audzēšanas gadā, ievērojot augu seku, drīkst stādīt kartupeļus sēklas ieguvei vai citiem mērķiem (pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētu kartupeļu ieguvei. Minētos kartupeļus pēc ražas novākšanas pārbauda saskaņā ar šo noteikumu 3.punktu;

15.1.2. ja fitosanitāro pasākumu piemēro piecus gadus pēc infekcijas konstatēšanas:

15.1.2.1. minētajā laikposmā iznīcināt pārziemojušos kartupeļus un citus organisma saimniekaugus;

15.1.2.2. pirmajos četros veģetācijas periodos laukā ierīkot un uzturēt melno papuvi, ganības, kuras pļauj bieži un zemu vai intensīvi nogana;

15.1.2.3. piektajā kartupeļu audzēšanas gadā, ja vismaz divos iepriekšējos veģetācijas periodos nav atrasti pārziemojuši kartupeļi un saimniekaugi, drīkst stādīt kartupeļus sēklas ieguvei vai citiem mērķiem (pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētu kartupeļu ieguvei. Minētos kartupeļus pēc ražas novākšanas pārbauda saskaņā ar šo noteikumu 3.punktu;

15.2. pārējos laukos, kas atrodas inficētajā zonā, kuros nav atrasti pārziemojuši kartupeļu augi un organisma saimniekaugi un kurus dienests ir pārbaudījis, ievēro augu seku un šādus nosacījumus:

15.2.1. pirmajā veģetācijas periodā pēc infekcijas konstatēšanas nedrīkst stādīt kartupeļu bumbuļus, to augus, sēt to sēklas vai organisma saimniekaugus. Dienests uzdod iznīcināt pārziemojušos kartupeļus vai atļauj stādīt tikai sertificētus sēklas kartupeļus citiem mērķiem (piemēram, pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētu kartupeļu ieguvei, ja ir iznīcināti visi pārziemojušie kartupeļi un organisma saimniekaugi un iepriekšējā gadā nav audzētas bietes;

15.2.2. otrajā veģetācijas periodā pēc infekcijas konstatēšanas izmantošanai pārtikā vai sēklas ieguvei atļauts stādīt sertificētus sēklas kartupeļus vai kartupeļus, kuros dienests nav konstatējis organismu, izņemot audzēšanas vietas, kas atzītas par inficētām;

15.2.3. trešajā kartupeļu audzēšanas gadā pēc infekcijas konstatēšanas izmantošanai pārtikā vai sēklas ieguvei atļauts stādīt sertificētus sēklas kartupeļus vai kartupeļus, kas izaudzēti no sertificētiem sēklas kartupeļiem;

15.2.4. katrā šo noteikumu 15.2.1. un 15.2.2.apakšpunktā minētajā veģetācijas periodā dienests uzdod iznīcināt pārziemojušos kartupeļus un organisma saimniekaugus un uzrauga šī pasākuma izpildi;

15.3. segtajās platībās aizliegts stādīt kartupeļu bumbuļus un to augus, kā arī organisma saimniekaugus, izņemot gadījumus, ja kartupeļu audzēšanai izmantoti sertificēti sēklas kartupeļi, sīkbumbuļi vai meristēmu augi, kuri ir pārbaudīti dienestā, kā arī ir veikta pilnīga augšanas substrāta nomaiņa un segto platību un iekārtu tīrīšana un dezinfekcija.

16. Dienests uzdod personai tā uzraudzībā:

16.1. tūlīt pēc infekcijas konstatēšanas, kā arī pēc nākamā veģetācijas perioda attīrīt un dezinficēt inficētās vai iespējami inficētās noliktavas, lauksaimniecības tehniku, transportlīdzekļus un citus priekšmetus, iznīcināt vai dezinficēt ar inficētajiem vai iespējami inficētajiem kartupeļiem saskarē nonākušo iepakojumu. Pēc dezinfekcijas šie objekti nav vairs uzskatāmi par inficētiem vai iespējami inficētiem;

16.2. tūlīt pēc infekcijas konstatēšanas un katrā nākamajā veģetācijas periodā līdz pirmajam atļautajam kartupeļu audzēšanas gadam laukos, kuri bija noteikti par inficētiem, veikt visas ar kartupeļu audzēšanu saistītās lauksaimniecības tehnikas un noliktavu, segto platību tīrīšanu, kā arī, ja iespējams, dezinfekciju;

16.3. audzēšanas vietās, kas atrodas inficētajā zonā, vismaz trīs gadus pēc infekcijas konstatēšanas:

16.3.1. sēklas kartupeļus novākt, uzglabāt un pārvietot atsevišķi no citiem mērķiem (pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētajiem kartupeļiem;

16.3.2. veikt visas ar kartupeļu audzēšanu saistītās lauksaimniecības tehnikas, glabātavu un segto platību tīrīšanu, kā arī, ja iespējams, dezinfekciju.

17. Lai noteiktu organisma iespējamo izplatību un sākotnējo infekcijas izcelšanās vietu, dienests pārbauda:

17.1. kartupeļu bumbuļus un to augus, kas saistīti ar inficēto kartupeļu partiju;

17.2. saimniecības, kas atrodas tās saimniecības tuvumā, kurā konstatēti inficētie kartupeļi.

18. Ja dienests organismu konstatē sākotnējā selekcijas materiālā, dienests veic sākotnējā selekcijas materiāla, izlases sēklu, bāzes vai augstāka ataudzējuma sēklas kartupeļu pārbaudes, ja to izcelsme saistīta ar inficēto sēklas kartupeļu partiju, un nosūta paraugu laboratoriskām analīzēm.

19. Dienests:

19.1. lēmumā norāda fitosanitāro pasākumu izpildes termiņu;

19.2. uzrauga un kontrolē fitosanitāro pasākumu izpildi;

19.3. lēmumā noteiktajā laikā vietās, kas noteiktas par inficētām vai iespējami inficētām, pēc ražas novākšanas veic kartupeļu pārbaudes;

19.4. uzrauga saimniecības, noliktavas un ar kartupeļu bumbuļu pārvieto­šanu sais­tītos uzņēmumus, kā arī saimniecības, kas izmanto lauksaimniecības tehniku uz līguma pamata kopīgi ar saimniecībām, kurās bija konstatēti inficētie kartupeļi;

19.5. lēmumam pievieno inficētās zonas karti.

20. Inficētajā zonā vismaz trīs nākamos veģetācijas periodus pēc infekcijas konstatēšanas dienests veic šo noteikumu 3.punktā minētās pārbaudes.

21. Ja kartupeļu audzētājs nav izpildījis dienesta noteiktos fitosanitāros pasākumus un inficētajās vai iespējami inficētajās platībās ir iestādījis inficētos vai iespējami inficētos, vai nesertificētus kartupeļus, tad dienests var piespiedu kārtā iznīcināt kartupeļu stādījumus ķīmiski vai mehāniski. Ar kartupeļu iznīcināšanu saistītos izdevumus sedz kartupeļu audzētājs.

III. Eiropas Komisijas un Eiropas Savienības dalībvalstu informēšana

22. Dienests nekavējoties informē Eiropas Komisiju un Eiropas Savienības dalībvalstis par katru gadījumu, kad laboratoriskajā analīzē iegūts pozitīvs testēšanas rezultāts. Paziņojumā norāda šādu informāciju:

22.1. fitosanitārajai kontrolei pakļauto augu un augu produktu apritē iesaistīto personu reģistrā reģistrētās saimniecības reģistrācijas numuru, ja saimniecībā atrodas audzēšanas vieta, kas noteikta par inficētu;

22.2. inficētajai saimniekaugu kravai vai partijai pievienoto fitosanitāro sertifikātu vai augu pasu numurus;

22.3. inficēto sēklas vai citiem mērķiem (pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētu kartupeļu šķirņu nosaukumus un sēklas kategoriju;

22.4. šo noteikumu 10.punktā minēto testu rezultātus par ekstraktu, imunofluorescences testam sagatavoto priekšmetstikliņu, inficēto baklažānu (Solanum melongena) materiālu un organisma tīrkultūru.

23. Dienests var piemērot tādus fitosanitāros pasākumus inficēto un iespējami inficēto kartupeļu izmantošanai, kādi nav minēti šo noteikumu 14.punktā. Pirms minēto pasākumu piemērošanas dienests par to informē Eiropas Komisiju un Eiropas Savienības dalībvalstis.

24. Ja ir inficēšanās risks no kartupeļiem, ko ieved no citas Eiropas Savienības dalībvalsts vai izved uz citu Eiropas Savienības dalībvalsti, un ir apstiprināta kartupeļu gaišā gredzenpuve, dienests nekavējoties par to informē attiecīgo dalībvalsti, iesniedzot paziņojumu kopā ar augu pases un piegādes dokumenta kopiju. Paziņojumā norāda:

24.1. inficētās kartupeļu partijas šķirnes nosaukumu;

24.2. nosūtītāja un saņēmēja vārdu, uzvārdu vai nosaukumu un adresi;

24.3. kartupeļu piegādes datumu;

24.4. piegādātās kartupeļu partijas lielumu;

24.5. ražotāja vai tirgotāja reģistrācijas numuru.

25. Dienests informē Eiropas Komisiju par katru organisma apstiprināšanas gadījumu, iesniedzot paziņojumu. Paziņojumā sniedz:

25.1. noteiktās inficēšanās aprakstu. Aprakstā norāda ražošanas vietu skaitu, kartupeļu partiju skaitu un kartupeļu šķirnes. Sēklas kartupeļiem norāda kategoriju;

25.2. izmeklēšanas aprakstu. Aprakstā norāda inficēšanās apstiprināšanas datumu, inficētās partijas lielumu un izsekojamību (inficēšanās avotus un iespējamo infekcijas izplatīšanos);

25.3. norobežotās zonas aprakstu. Aprakstā norāda ražošanas vietu skaitu, kuras nav atzītas par inficētām, bet ir iekļautas attiecīgajā zonā.

IV. Noslēguma jautājumi

26. Atzīt par spēku zaudējušiem Ministru kabineta 2005.gada 26.jūlija noteikumus Nr.569 "Kartupeļu gaišās gredzenpuves apkarošanas un izplatības ierobežošanas kārtība" (Latvijas Vēstnesis, 2005, 124.nr.).

27. Šo noteikumu 5.punkts stājas spēkā ar 2009.gada 1.janvāri.

Informatīva atsauce uz Eiropas Savienības direktīvām

Noteikumos iekļautas tiesību normas, kas izriet no:

1) Padomes 1993.gada 4.oktobra Direktīvas Nr.93/85/EEK par kartupeļu gaišās gredzenpuves kontroli;

2) Komisijas 2006.gada 12.jūnija Direktīvas Nr.2006/56/EK, ar ko groza pielikumus Padomes Direktīvā Nr.93/85/EK par kartupeļu gaišās gredzenpuves kontroli.

Ministru prezidents A.Kalvītis

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
1.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.365

Organisma noteikšana kartupeļu bumbuļos un augos

1. Paraugu sagatavošana:

1.1. Kartupeļu bumbuļi:

1.1.1. standarta paraugs ir 200 bumbuļi katram testam. Intensīvākai paraugu ņemšanai nepieciešami papildu testi, izmantojot šāda lieluma paraugu. Ja bumbuļu skaits paraugā ir lielāks, iespējams, tests nedos rezultātus vai tie būs grūti interpretējami. Tomēr, ja nav pieejams nepieciešamais daudzums, šī procedūra labi izmantojama arī paraugiem, kuros ir mazāk nekā 200 bumbuļu. Visas turpmāk aprakstītās metodes validētas, testējot paraugus no 200 bumbuļiem;

1.1.2. papildu pirmapstrāde pirms parauga sagatavošanas. Nomazgāt kartupeļu bumbuļus. Izmantot atbilstošus dezinfekcijas līdzekļus (ja veic PCR testu, izmanto hlora savienojumus, lai notīrītu iespējamo patogēna DNS) un mazgāšanas līdzekļus katram paraugam. Ļaut bumbuļiem nožūt. Mazgāšana ir lietderīga (taču nav obligāta) paraugiem, uz kuriem ir lieka augsnes kārta, un gadījumos, ja veic PCR testu vai tiešās izolācijas testu;

1.1.3. ar tīru dezinficētu skalpeli vai dārzeņu nazi noņemt mizu pie katra bumbuļa stolona pamatnes, atsedzot vadaudus. Izgriezt nelielu vadaudu gabalu no stolona pamatnes, cenšoties izgriezt pēc iespējas mazāk bumbuļa mīkstuma. Atlasīt visus bumbuļus, kuriem ir iespējami organisma simptomi, un testēt tos atsevišķi. Ja stolona pamatnes vidus gabala atdalīšanas laikā redzami gaišās gredzenpuves organisma simptomi, veic attiecīgā bumbuļa vizuālo pārbaudi, bumbuli iegriežot pie stolona pamatnes. Visus bumbuļus, kuriem ir attiecīgi organisma simptomi, ne mazāk kā divas dienas glabā istabas temperatūrā, lai notiktu pārkoksnēšanās, pēc tam bumbuļus noglabā vēsumā (4 - 10⁰ C temperatūrā) karantīnā līdz testēšanas beigām. Visus bumbuļus, tostarp tos, kuriem ir aizdomīgi simptomi, uzglabā;

1.1.4. savākt stolona pamatnes vidus gabalus jaunos vienreizlietojamos konteineros, kurus var aizvērt vai cieši noslēgt (ja izmanto vairākkārt lietojamus traukus, tos rūpīgi iztīra un dezinficē ar hloru saturošiem savienojumiem). Stolona pamatnes ieteicams apstrādāt nekavējoties. Ja tas nav iespējams, tās ne ilgāk kā 72 stundas atvēsinātā veidā un ne vairāk kā 24 stundas istabas temperatūrā var konteinerā uzglabāt, nepievienojot buferšķīdumu. Vadaudu gabalu izžūšana, pārkoksnēšanās un saprofītu augšana uzglabāšanas laikā var traucēt kartupeļu gaišās gredzenpuves izraisītājas baktērijas noteikšanu;

1.1.5. apstrādāt stolona pamatnes vad­audu gabalus, izmantojot vienu no turpmākajām metodēm:

1.1.5.1. stolona pamatnes vadaudu gabalus pārliet ar pietiekamu daudzumu ekstrakcijas buferšķīduma (apm. 40 ml) saskaņā ar šo noteikumu 3.pielikumu un četras stundas kratīt rotācijas kratītājā (50 - 100 apgriezienu/minūtē) temperatūrā, kas zemāka par 24⁰ C, vai 16 - 24 stundas gadījumā, ja tie ir atdzesēti;

1.1.5.2. vadaudu gabalus homogenizēt mikserī (Waring vai Ultra Thurax), ar pietiekamu (apmēram 40 ml) daudzumu ekstrakcijas buferšķīduma (3.pielikums), vai ar gumijas āmuru vai atbilstošu smalcinātāju (piemēram, Homex) sasmalcināt cieši noslēgtā vienreizlietojamā macerācijas maisiņā (piemēram Stomacher vai Bioreba jonizējošā starojumā sterilizētā polietilēna 150 mm x 250 mm maisiņā). Ja paraugi tiek homogenizēti mikserī, savstarpējas inficēšanās risks ir ļoti augsts. Veic piesardzības pasākumus, lai izvairītos no aerosola veidošanās vai izlīšanas ekstrakcijas procesa laikā.
Nodrošina, ka katram parau­gam tiek izmantoti sterilizēti miksera asmeņi un trauki. Ja veic PCR tests, izvairās no DNS pārnešanas uz traukiem vai smalcināšanas ierīcēm. PCR testam sasmalcināšanu veic vienreizlietojamos maisiņos vai traukos;

1.1.6. virsējo dzidro šķidruma slāni dekantēt. Ja šķidrums ir pārāk duļķains, to dzidrina, lēni centrifugējot (10 minūtes 4 - 10⁰ C temperatūrā, ne vairāk kā ar 180 gramiem) vai izmantojot vakuumfiltrēšanu (40 - 100 m) un mazgājot filtru ar papildu ekstrakcijas šķīdumu (10 ml);

1.1.7. koncentrēt baktēriju frakcijas, 4 - 10⁰ C temperatūrā 15 minūtes centrifugējot ar 7000 gramiem (vai 10 minūtes ar 10 000 gramiem), virsējo dzidro šķidruma slāni noliet, neuzduļķojot nogulsnes;

1.1.8. nogulsnes vēlreiz suspendēt 1,5 ml buferšķīduma. Izmantot 500 mkl organisma testēšanai, un 500 mkl Ralstonia solanacearum un 500 mkl references vajadzībām. References alikvotai un atlikušajai testa alikvotai pievienot sterilu glicerīnu, līdz galīgai koncentrācijai 10 - 25 % (v/v), 500 mkl, sajaukt un glabāt - 16 līdz - 24⁰ C temperatūrā (nedēļas) vai - 68 līdz - 86⁰ C (mēnešus). Testēšanas laikā atlikušo paraugu glabāt 4 - 10⁰ C temperatūrā. Atkārtoti sasaldēt un atkausēt ekstraktu nav ieteicams. Ja ekstraktu transportē, to pārvadā aukstumkastē 24 - 48 stundu laikā;

1.1.9. organisma pozitīvos kontrolparaugus un paraugus apstrādā atsevišķi, lai izvairītos no inficēša­nās. Tas attiecas uz IF priekšmetstikliņiem un uz visiem testiem.

1.2. kartupeļu augi:

1.2.1. lai noteiktu latentas organisma populācijas, ieteicams testēt apvienotos paraugus. Procedūru var izmantot arī apvienotiem paraugiem no ne vairāk kā 200 stublāju daļām (apsekojumos izmanto statistiski reprezentatīvi izmeklējamās augu populācijas paraugi). Ar tīru dezinficētu nazi vai atzarošanas šķērēm atdalīt 1 - 2 cm lielu segmentu no katra stublāja pamata pavisam nedaudz virs augsnes līmeņa. Neilgu laiku dezinficēt stublāju segmentus ar 70 % metanolu un nekavējoties nosusināt ar papīra salveti;

1.2.2. ielikt stublāju segmentus slēgtā sterilā traukā, ievērojot šādas paraugu ņemšanas procedūras:

1.2.2.1. apstrādāt stumbru segmentus pēc vienas no turpmāk minētajām metodēm:

1.2.2.1.1. apliet stublāju segmentus ar pietiekamu daudzumu (aptuveni 40 ml) ekstrakcijas buferšķīduma un kratīt rotācijas kratītājā (50 100 apgriezienu/minūtē) četras stundas temperatūrā zem 24⁰ C vai 16 - 24 stundas atvēsinātā veidā;

1.2.2.1.2. apstrādāt nekavējoties. Stublāju segmentus homogenizēt ar daudzumu ekstrakcijas šķīdumu izturīgā macerācijas maisiņā (piemēram, Stomacher vai Bioreba), sasmalcinot tos ar gumijas āmuru vai atbilstošu smalcinātāju (piemēram, Homex). Ja uzreiz apstrādāt nevar, stublāju segmentus vēsumā var uzglabāt līdz 72 stundām, bet istabas temperatūrā - līdz 24 stundām;

1.2.2.2. nostādināt 15 minūtes, tad virsējo dzidro slāni noliet;

1.2.2.3. baktēriju frakcijas ekstraktu vai koncentrātu parasti nav nepieciešams papildus dzidrināt, bet to var izdarīt filtrējot vai centrifugējot, kā aprakstīts iepriekš;

1.2.2.4. sadalīt neatšķaidīto vai koncentrēto parauga ekstraktu divās vienādās daļās. Vienu daļu uzglabāt 4 - 10⁰ C temperatūrā visu testa laiku, otru daļu, ja nepieciešama turpmāka testēšana, pēc 10 - 25 % (v/v) sterila glicerīna pievieno­šanas glabāt - 16 līdz - 24⁰ C temperatūrā (nedēļām ilgi) vai - 68 līdz - 86⁰ C temperatūrā (mēnešiem);

2. IF tests:

2.1. IF testu ieteicams izmantot par galveno skrīninga testu;

2.2. ja IF testu izmanto kā galveno skrīninga testu un IFtesta rezultāts ir pozitīvs, par otro skrīninga testu izmanto PCR vai FISHtestu. Ja IF testu izmanto kā otro skrīninga testu un tā rezultāts ir pozitīvs, lai pabeigtu analīzes, saskaņā ar testēšanas shēmu veic papildu testēšana. Ja par galveno skrīninga testu izmanto IF testu, lieto poliklonālo antivielu. Ja IF testam ar poliklonālo antivielu ir pozitīvs rezultāts, papildus skrīningam ar monoklonālo antivielu var būt labāks specifiskums, bet zemāka jutība. Izmanto organisma references celma antivielas. Ieteicams noteikt titru katrai jaunai antivielu partijai. Titrs tiek definēts kā vislielākais atšķaidījums, pie kura panāk optimālu reakciju, testējot suspensiju, kuras vienā mililitrā ir 10⁵ līdz 10⁶ homo-loga organisma celma šūnu, un saskaņā ar ražotāja norādījumiem izmantojot atbilstošu fluoresceīna izotiocianāta (FITC) konjugātu. Neattīrītu poliklonālo un monoklonālo antivielu IF titram jābūt vismaz 1:2 000. Testēšanas laikā antivielas izmanto darba atšķaidījumā (DA), kas vienāds ar titru vai tam tuvu. Izmantot validētas antivielas. Testu veic, izmantojot tikko sagatavotus paraugu ekstraktus. Nepieciešamības gadījumā testu var sekmīgi veikt, izmantojot ekstraktus, kas glabāti - 68 līdz - 86⁰ C temperatūrā glicerīna šķīdumā. Glicerīnu no parauga atdala, pievienojot venu ml ekstrakta koncentrāta buferšķīduma, atkārtoti 15 minūtes centrifugējot ar 7 000 gramiem un vēlreiz suspendējot tāda paša daudzuma ekstrakta koncentrāta buferšķīduma. Dažkārt tas nav nepieciešams, jo īpaši, ja paraugs ir fiksēts uz priekšmetstikliņa ar liesmu. Sagatavot atsevišķus pozitīvās kontroles priekšmetstikliņus homologam celmam vai kādam citam references organisma celmam, suspendējot kartupeļu ekstraktā, kā noteikts šo noteikumu 9.pielikumā vai buferšķīduma. Ja iespējams, uz tā paša priekšmetstikliņa par līdzīgu kontrolparaugu izmanto dabīgi inficēti audi (kas saglabāti, liofilizējot vai sasaldējot - 16 līdz - 24⁰ C temperatūrā). Par negatīvo kontrolparaugu izmantot parauga ekstrakta daļu, kas iepriekš uzrādījis negatīvu rezultātu. Izmantot daudzlodziņu priekšmetstikliņus, kuriem vēlams būt 10 lodziņiem ar diametru vismaz seši milimetri. Kontroles materiālu testē tāpat kā paraugu;

2.3. sagatavot testu priekšmetstikliņus, izmantojot vienu no šādām procedūrām:

2.3.1. ekstrakti ar relatīvi nelielām cietes nogulsnēm. Uz pirmā lodziņa ar pipeti pārnest standartdaudzumu (15 ul atbilst lodziņam ar sešu mm diametru - lielākiem lodziņiem šo daudzumu proporcionāli palielināt) atkārtoti suspendēta kartupeļu ekstrakta koncentrāta šķīdumā 1/100. Pēc tam līdzīgu daudzumu neatšķaidīta ekstrakta koncentrāta (1/1) iepilināt atlikušajos lodziņos rindā. Otro rindu var izmantot kā dublikātu vai otram paraugam (1.attēls);

1.attēls

Testa priekšmetstikliņa sagatavošana antivielu titra noteikšanai

2.3.2. citi ekstrakti. Sagatavot atkārtoti suspendētā ekstrakta koncentrāta decimālatšķaidījumus (1/10 un 1/100) buferšķīdumā. Lodziņu rindā ar pipeti pārnest standartdaudzumu (15 ul atbilst lodziņam ar sešu mm diametru - lielākiem lodziņiem šo daudzumu proporcionāli palielināt) tīras ekstrakta suspensijas un katra šķīduma. Otro rindu var izmantot kā dublikātu vai otram paraugam (2.attēls);

2.attēls

Testa priekšmetstikliņa sagatavošana

2.4. pilienus izžāvēt apkārtējās vides temperatūrā vai sildot 40 - 45⁰ C. Baktēriju šūnas nofiksēt uz priekšmetstikliņa, karsējot (15 min 60⁰ C temperatūrā), apdedzinot ar liesmu, izmantojot 95 % etanolu vai saskaņā ar antivielu piegādātāju instrukcijām. Nepieciešamības gadījumā fiksētos priekšmetstikliņus līdz turpmākai testēšanai var glabāt sasaldētā veidā sausā noslēgtā kamerā iespējami neilgi (ne ilgāk kā trīs mēnešus);

2.5. IF procedūra:

2.5.1. sagatavo testēšanai priekšmetstikliņus:

2.5.1.1. sagatavot antivielu divkāršus atšķaidījumus IF buferšķīdumā. Pirmā iedobe ir 1/2 titra (T/2), pārejas 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), pilnam titram (T) un divkāršam titram (2T);

2.5.1.2. sagatavot testēšanai priekšmetstikliņus. Sagatavot antivielu darba atšķaidījumu (DA) IF buferšķīdumā. Darba atšķaidījums ietekmē specifiskumu;

2.5.2. priekšmetstikliņus novietot uz samitrināta papīra. Katru testēšanas lodziņu pilnībā pārklāt ar antivielas atšķaidījumu. Antivielu daudzums, ko uzpilina katrā lodziņā, ir vienāds ar ņemtā ekstrakta tilpumu. Ja nav īpašu norādījumu no antivielu piegādātājiem, veic šādu procedūru:

2.5.2.1. priekšmetstikliņus 30 minūtes inkubē uz samitrināta papīra apsegtā veidā apkārtējās vides temperatūrā (18 - 25⁰ C);

2.5.2.2. nokrata pilienus no katra priekšmetstikliņa un rūpīgi noskalo ar IF buferšķīdumu. Mazgā, uz piecām minūtēm iemērcot IF-Tween buferšķīdumā un pēc tam uz piecām minūtēm IF buferšķīdumā. Izvairīties no aerosolu vai pilienu pārnešanas, kas var izraisīt sasvstarpēju inficēšanos. Uzmanīgi noņemt lieko mitrumu, viegli nosusinot;

2.5.2.3. priekšmetstikliņus novietot uz mitrām papīra salvetēm. Nosegt testa lodziņus ar FITC konjugāta atšķaidījumu, ko izmantoja titra noteikšanai. Konjugāta tilpums, kas uzklāts lodziņiem, ir vienāds ar izmantoto antivielu tilpumu;

2.5.2.4. priekšmetstikliņus 30 minūtes inkubē uz samitrināta papīra apsegtā veidā apkārtējās vides temperatūrā (18 - 25⁰ C);

2.5.2.5. nokratīt konjugāta pilienus no priekšmetstikliņa. Noskalot un nomazgāt kā minēts iepriekš. Nosusināt lieko šķidrumu;

2.5.2.6. ar pipeti katrā lodziņā pārnest 5 - 10 mkl 0,1 M fosfātbuferēta glicerīna vai tirdzniecībā pieejamas saistvielas, kas sekmē krāsas noturīgumu, un uzlikt segstikliņu;

2.6. IF testa rezultātu nolasīšana:

2.6.1. testa priekšmetstikliņus pārbaudīt ar epifluorescences mikroskopu eļļas vai ūdens imersijā 500 līdz 1 000 reižu palielinājumā, izmantojot filtrus, kas piemēroti darbam ar FITC. Lodziņus apskatīt pa diviem diametriem, kas krustojas taisnā leņķī, un pa perimetru. Attiecībā uz paraugiem, kuri uzrāda nelielu daudzumu šūnu, izskatīt vismaz 40 mikroskopa lauciņus. Vispirms pārbaudīt pozitīvā kontrolparauga priekšmetstikliņu. Šūnām jābūt spilgti fluorescējošām un pilnībā iekrāsotām pie noteiktā antivielu titra vai darba šķīduma. IF testu atkārto, ja krāsojumam ir novirze no normālā;

2.6.2. pārbaudīt, vai priekšmetstikliņu testa lodziņos ir redzamas spilgtas fluorescējošas šūnas ar organisma raksturīgo morfoloģiju. Fluorescencesintensitātei jābūt tādai pašai kā pozitīvajam kontroles celmam tajā pašā antivielu atšķaidījumā vai intensīvākai. Šūnas ar nepilnīgu iekrāsojumu vai vāju fluorescenci netiek ņemtas vērā. Testu atkārto, ja ir aizdomas par inficēšanos. Tas var būt gadījumā, ja visi attiecīgās partijas priekšmetstikliņi uzrāda inficētas šūnas sakarā ar buferšķīduma inficēšanu vai ja inficētas šūnas tiek konstatētas uz segstikliņa (ārpus priekšmetstikliņa lodziņiem);

2.6.3. pastāv vairākas imunofluorescences testam raksturīgas problēmas. Netipiskas morfoloģijas fluorescento šūnu fona populācijas un nespecifiski reaģējošas saprofītās baktērijas, kuru izmērs un morfoloģija ir līdzīgi organismi, varētu rasties kartupeļu ekstrakta koncentrātā no stolona pamanes gabaliem un kartupeļu lakstu segmentiem;

2.6.4. ņem vērā tikai fluorescējošas šūnas ar izmēru un morfoloģiju, kas ir tipiska antivielu titra vai darba atšķaidījumam;

2.7. IF testa nolasījuma interpretācija:

2.7.1. ja ir atrastas spilgti fluorescējošas šūnas ar raksturīgo morfoloģiju, noteikt raksturīgo šūnu vidējo skaitu mikroskopa lauciņā un aprēķināt raksturīgo šūnu skaitu vienā mililitrā atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta. IF testa rezultātu uzskata par tiem paraugiem, kuros ir ne mazāk kā 5 x 10³ tipisko šūnu uz vienu mililitru atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta. Paraugu uzskata par potenciāli inficētu un ir nepieciešama turpmāka testēšana;

2.7.2. IF testa rezultātu uzskata par negatīvu paraugiem, kuros ir mazāk nekā 5 x 10 tipisko vai netipisko šūnu uz vienu mililitru atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta, un paraugu uzskata par negatīvu. Turpmāko testēšanu neveic.

3. FISH tests:

3.1. ja FISH testu izmanto kā pirmo skrīninga testu un FISH testa rezultāts ir pozitīvs, kā otro obligāto skrīninga testu izmanto IFtestu. Ja FISH testu izmanto kā otro skrīninga testu un tā rezultāts ir pozitīvs, lai noteiktu galīgo diagnozi, veic turpmāko testēšanu. Izmantot validētās īpašās C. m. subsp. sepedonicus oligozondes. Obligāta ir prasība par to, ka iepriekšē­jie testi pēc šīs metodes nodrošina reproducējama noteikšanu 10³ - 10⁴ organisma šūnas uz vienu mililiru, kuras pievienotas paraugu ekstraktiem, kas iepriekš uzrādījuši negatīvus rezultātus. Turpmāk minēto procedūru ieteicams veikt uz tikko sagatavota ekstrakta parauga, bet to var veiksmīgi īstenot, izmantojot ekstrakta paraugus, kas glabāti glicerīna šķīdumā - 16 līdz - 24⁰ C vai - 68 līdz - 86⁰ C temperatūrā. Kā negatīvo kontrolmateriālu izmantot daļu no parauga ekstrakta, kas pirms tam uzrādīja negatīvu rezultātu attiecībā uz organisma klātbūtni. Kā pozitīvos kontrolparaugus sagatavo suspensijas, kas satur 10⁵ līdz 10⁶ organisma šūnas mililitrā (piemēram, NCPPB 4053 celms vai PD 406 celms) 0,01 M fosfāta buferšķīdumā (FB), izmantojot 3 - 5 dienu uzsējumu. Sagatavot atsevišķus homologu organisma vai citu references celmu pozitīvo kontrolparaugu priekšmetstikliņus, izmantojot kartupeļu ekstrakta suspensiju. Ar FITC marķētās eubaktēriju oligozondes izmantošana paredz hibridizācijas procesa kontroli, jo tā iekrāso visas eubaktērijas, kas atrodas paraugā. Testēt kontroles materiālu tāpat kā paraugu;

3.2. kartupeļu ekstrakta fiksēšana:

3.2.1. protokola pamatā ir Wullings et al. (1998);

3.2.2. sagatavot fiksējošo šķīdumu;

3.2.3. pārnest 100 mkl katra ekstrakta parauga mikromēģenē, un astoņas minūtes centrifugē ar 7 000 gramiem;

3.2.4. atdalīt virsējo slāni un ekstrakta koncentrātu izšķīdina 500 mkl fiksatora, kas sagatavots vismaz 24 stundas iepriekš. Samaisa un 4⁰ C temperatūrā iztur līdz nākamajai dienai. Kā alternatīvu fiksatoru var izmantot 96 % etanolu. Lai to izmantotu, izšķīdināt paredzēto ekstrakta koncentrātu, 50 mkl 0,01M FB un 50 mkl 96 % etanola. Samaisīt un 4⁰ C temperatūrā izturēt 30 - 60 minūtes;

3.2.5. centrifugēt astoņas minūtes ar 7 000 gramiem, atdalīt virsējo slāni un atkārtoti suspendēt ekstrakta koncentrātu 75 mkl 0,01M FB;

3.2.6. pārnest 16 mkl fiksējošās suspensijas uz tīra daudzkārt izmantojama priekšmetstikliņa (3.attēls);

3.attēls

FISH priekšmetstikliņa shēma

Uz katra priekšmetstikliņa uznes divus dažādus neatšķaidītus paraugus, un 1:100 atšķaidījuma sagatavošanai (0,01M FB), izmanto 10 mkl. Atlikušo šķīdumu (49 mkl), pievienojot 1 tilp. 96 % etanola, var glabāt - 20 °C temperatūrā. Gadī­jumā, ja FISH testu atkārto, etanolu atdala centrifugējot, un pievieno tādu pašu daudzumu 0,01M FB (samaisot ar vorteksu);

3.2.7. ļaut priekšmetstikliņiem nožūt (vai žāvēt eksikatorā 37 °C temperatūrā) un fiksēt ar liesmu. Šajā posmā procedūru var pārtraukt, un hibridizāciju var turpināt nākamajā dienā. Priekšmetstikliņus uzglabā istabas temperatūrā sausā telpā, kurā nav putekļu;

3.3. hibridizācijas sagatavošana un hibridizācija:

3.3.1. sagatavot lizocīma šķīdumu, kas satur 10 mg lizocīma (Sigma L-6876) 10 ml buferšķīduma (100 mM Tris-HCl, 59 mM ADTA, pH 8,0). Šo šķīdumu var uzglabāt, bet to drīkst sasaldēt un atkausēt tikai vienu reizi. Katru paraugu pārklāj ar aptuveni 50 mkl lizocīma šķīduma un tur 10 minūtes istabas temperatūrā. Tad priekšmetstikliņus vienu reizi iemērc demineralizētā ūdenī un nosusina ar filtrpapīru. Alternatīvi lizocīma vietā katrā iedobē pārnes 50 mkl 40-400 mkg ml^-1 K proteniāzes buferšķīdumā (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl₂, pH 7,4) un 37⁰ C temperatūrā inkubē 30 minūtes;

3.3.2. šūnas dehidratēt, secīgi uz vienu minūti iemērcot 50 %, 80 % un 96 % etanolā. Priekšmetstikliņus nožāvē priekšmetstikliņu statīvā;

3.3.3. sagatavot mitro inkubācijas kameru, izklājot hermētiska boksa apakšu ar salveti vai filtrpapīru, kas iemērkts vienu reizi hibridizācijas šķīdumā. Sagatavot boksu inkubācijai, vismaz uz 10 minūtēm ievietojot hibridizācijai žāvēšanas skapī 55⁰ C temperatūrā;

3.3.4. sagatavot hibridizācijas šķīdumu, katram priekšmetstikliņam paredzot 45 mkl, un 5 minūtes turēt 55⁰ C temperatūrā;

3.3.5. novietot priekšmetstikliņus uz sildvirsmas 45⁰ C temperatūrā un pievienot pa 10 mkl hibridizācijas šķīduma visos četros iedobumos uz priekšmetstikliņa;

3.3.6. katram priekšmetstikliņam uzlikt divus segstikliņus (24 x 24 mm), izspiežot gaisu. Hibridizācijai priekšmetstikliņus līdz nākamajai dienai novietot tumsā iepriekš uzsildītā mitruma kamerā 55⁰ C temperatūrā žāvēšanas skapī;

3.3.7. sagatavot trīs vārglāzes, kurās ir viens litrs ultratīra ūdens, vienu litru 1x hibridizācijas maisījuma (334 ml 3x hibridizācijas maisījuma un 666 ml ultratīra ūdens) un 1 l 1/2x hibridizācijas maisījuma (167 ml 3x hibridizācijas maisījuma un 833 ml ultratīra ūdens). Tās sagatavot inkubācijai ūdens vannā 55⁰ C temperatūrā;

3.3.8. no priekšmetstikliņiem noņemt segstikliņus un novietot priekšmetstikliņus statīvā;

3.3.9. noskalot lieko parauga daudzumu, 15 minūtes izturot vārglāzē ar 1x hibridizācijas maisījumu 55⁰ C temperatūrā;

3.3.10. ievietot priekšmetstikliņu statīvu 1/2 hibridizācijas maisījuma mazgāšanas šķīdumā un inkubēt vēl 15 minūtes;

3.3.11. uz īsu brīdi iemērkt priekšmetstikliņus ultratīrā ūdenī un novietot uz filtrpapīra. Nosusināt lieko mitrumu, virsmu uzmanīgi pārsedzot ar filtrpapīru. Katrā lodziņā pievienot 5 - 10 mkl krāsojuma noturīgumu sekmējoša histoloģiskā šķīduma (piemēram, Vectashield, Vecta Laboratories, Kanāda, ASV vai līdzvērtīga šķīduma) un visu priekšmetstikliņu nosegt ar lielo segstikliņu (24 x 60 mm);

3.4. FISH testa rezultātu nolasīšana:

3.4.1. ar epifluorescences mikroskopu nekavējoties priekšmetstikliņus imersijas eļļā aplūkot 630 vai 1 000 x palielinā­jumā. Ar filtru, kas piemērots fluoresceīna izotiocianātam (FITC), eubaktēriju šūnas (tostarp izteiktākās gramnegatīvās šūnas) paraugā krāso fluorescējoši zaļā krāsā. Izmantojot tetrametilrodamīna 5-izotiocianāta filtru, Cy3 iekrāsotās organisma šūnas izskatās fluorescējoši sarkanas. Salīdzināt šūnu morfoloģiju ar pozitīvo kontrolmateriālu morfoloģiju. Šūnām jābūt spilgti luminiscējošām un pilnībā iekrāsotām. FISH testu aatkārto, ja krāsojumam ir novirze no normālā. Lodziņus apskatīt pa diviem diametriem, kas krustojas taisnā leņķī, un pa perimetru. Attiecībā uz paraugiem, kuri uzrāda nelielu daudzumu šūnu, aplūkot vismaz 40 mikroskopa lauciņus;

3.4.2. pārbaudīt, vai priekšmetstikliņu testa lodziņos ir redzamas spilgtas fluorescējošas šūnas ar organisma raksturīgo morfoloģiju. Fluorescences intensitātei jābūt tādai pašai kā pozitīvajam kontroles celmam vai intensīvākai. Šūnas ar nepilnī­gu iekrāsojumu vai vāju fluorescenci netiek ņemtas vērā;

3.4.3. ja ir aizdomas par inficēšanos, testu atkārto. Tas var būt gadījumā, ja visi attiecīgās partijas priekšmetstikliņi uzrāda inficētas šūnas sakarā ar buferšķīduma inficēšanu vai ja inficētas šūnas tiek konstatētas uz segstikliņa (ārpus priekšmetstikliņa lodziņiem);

3.4.4. pastāv vairākas FISH testam raksturīgas problēmas. Ekstraktos no kartupeļu stolona pamatnēm un lakstu segmentiem varētu rasties netipiskas morfoloģijas fluorescences šūnu fona populācijas un nespecifiski reaģējošas saprofītās baktērijas, kuru izmērs un morfoloģija ir organismam, taču tas notiek daudz retāk, nekā veicot IF testu;

3.4.5. ņem vērā tikai fluorescējošas šūnas ar tipisku morfoloģiju un raksturīgo izmēru.

3.4.6. FISH testa rezultātu interpretēšana:

3.4.6.1. derīgus FISH testa rezultātus iegūst, ja visos pozitīvajos kontrolparaugos, izmantojot FITC filtru, konstatē koši zaļas fluorescējošas šūnas ar organismam raksturīgo izmēru un morfoloģiju un, izmantojot rodamīna filtru, konstatē sarkanas fluorescējošas šūnas, un tās netiek konstatētas nevienā negatīvajā kontroltestā. Ja ir atrastas spilgti fluorescējošas šūnas ar raksturīgo morfoloģiju, noteikt raksturīgo šūnu vidējo skaitu mikroskopa lauciņā un aprēķināt raksturīgo šūnu skaitu vienā mililitrā atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta (4.pielikums). Paraugus, kuros konstatē ne mazāk kā 5 x 10³ tipisko šūnu 1 ml atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta, uzskata par potenciāli inficētiem. Nepieciešama turpmāka testēšana. Paraugus, kuros konstatē mazāk nekā 5 x 10 tipisko šūnu vienu mililitru atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta, uzskata par neinficētiem;

3.4.6.2. FISH testa rezultāts ir negatīvs, ja, izmantojot rodamīna filtru, netiek konstatētas koši sarkanas fluorescējošas šūnas ar organismam raksturīgo izmēru un morfoloģiju, ar nosacījumu, ka raksturīgās koši sarkanās fluorescējošās šūnas konstatē pozitīvajos kontrolparaugos, izmantojot rodamīna filtru;

4. PCR tests:

4.1. ja PCR testu izmanto kā galveno skrīninga testu un tā rezultāts ir pozitīvs, kā otro obligāto skrīninga testu izmanto IF testu. Ja PCR testu izmanto kā otro skrīninga testu un tā rezultāts ir pozitīvs, lai noteiktu galīgo diagnozi, veic turpmāko testēšanu saskaņā ar parauga testēšanas shēmu. Izmantot šo metodi kā galveno skrīninga testu ieteicams tikai gadījumos, kad ir iegūta pieredze tā izmantošanā. Iepriekšējiem testiem pēc šīs metodes jānodrošina reproducējama 10³ līdz 10⁴ organisma šūnu uz viena mililitra noteikšana, ja tās pievieno paraugu ekstraktiem, kas iepriekš uzrādījuši negatīvus rezultātus. Var būt nepieciešami optimizācijas eksperimenti, lai visās laboratorijās panāktu maksimālo jutību un specifiskumu. Izmantot validētus PCR reaģentus un protokolus. Ieteicams izvēlēties metodi ar iekšējo kontroli. Veikt piemērotus piesardzības pasākumus, lai izvairītos no parauga inficēšanas ar mērķa DNS. PCR testu veic pieredzējuši speciālisti īpaši tam paredzētās molekulārās bioloģijas laboratorijās, lai samazinātu iespējas paraugu inficēt ar mērķa DNS. Negatīvie kontroltesti (DNS ekstrakcija un PCR) vienmēr izmanto kā procedūras galīgais paraugs, lai konstatētu, vai ir notikusi DNS pārnese;

4.2. PCR testā ietver šādus negatīvos paraugus:

4.2.1. ekstrakta paraugu, kas pirms tam uzrādījis negatīvu rezultātu attiecībā uz organisma klātbūtni;

4.2.2. buferšķīduma paraugus, kas izmantoti baktērijas un DNS ekstrahēšanai no parauga;

4.2.3. PCR reakcijas maisījumu;

4.3. iekļauj šādus pozitīvos kontrolparaugus:

4.3.1. atkārtoti suspendētu ekstraktu daļas, kurām pievienota organismam;

4.3.2. no virulenta izolāta iegūta ūdens suspensija ar 10⁶ organisma šūnām uz vienu mililitru (piemēram, NCPPB 2140 vai NCPPB 4053);

4.3.3. ja iespējams, izmantot arī DNS, kas iegūta no pozitīvajiem kontrolparaugiem, veicot PCR testu. Lai izvairītos no iespējamās inficēšanās, pozitīvo kontrolparaugu sagatavošanu telpiski nodala atsevišķi no testējamajiem paraugiem. Paraugu ekstraktus iespējami attīra no augsnes. Tādēļ gadījumos, kad izmanto PCR protokols, ieteicams sagata­vot ekstraktus no mazgātiem kartupeļiem;

4.4. DNS attīrīšanas metodes:

4.4.1. izmantot pozitīvos un negatīvos kontrolparaugus saskaņā ar aprakstu iepriekš. Sagatavot kontroles materiālu tāpat kā paraugu;

4.4.2. sarežģītu paraugu substrātu gadījumā mērķa DNS attīrīšanai ir pieejamas dažādas metodes, kas ļauj atdalīt PCR inhibitorus, novērst citas fermentatīvas reakcijas un koncentrēt mērķa DNS parauga ekstraktā;

4.4.3. lietošanai kopā ar validēto PCR metodi ir optimizēta šāda metode:

4.4.3.1. Pastrik (2000) metode:

4.4.3.1.1. pārnest 220 mkl lizēšanas buferšķīduma (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml tilpuma mikromēģenē;

4.4.3.1.2. pievienot 100 mkl parauga ekstrakta un uz 10 min novietot sildīšanas blokā vai ūdens vannā 95⁰ C temperatūrā;

4.4.3.1.3. mēģeni 5 minūtes turēt ledū;

4.4.3.1.4. pievienot 80 mkl lizocīma standartšķīduma (50 mg lizocīma uz 1 ml 10 mM Tris HCl, pH 8,0) un 30 min turēt 37⁰ C temperatūrā;

4.4.3.1.5. pievienot 220 mkl Easy DNA® šķīduma A (Invitrogen), labi samaisīt un 30 min turēt 65⁰ C temperatūrā;

4.4.3.1.6. pievienot 100 mkl Easy DNA® šķīduma B (Invitrogen), rūpīgi samaisīt ar vorteksu, līdz paraugs kļūst viendabīgi viskozs;

4.4.3.1.7. pievienot 500 mkl hloroforma un maisīt, līdz viskozitāte samazinās un maisījums kļūst viendabīgs;

4.4.3.1.8. centrifugēt 20 min 4⁰ C temperatūrā pie 15 000 g, lai atdalītu fāzes un veidotu starpfāzi;

4.4.3.1.9. pārnest virsējo fāzi tīrā mikromēģenē;

4.4.3.1.10. pievienot vienu mililitru 100 % etanola (- 20⁰ C), īsu brīdi maisīt vorteksā un izturēt uz ledus 10 minūtes;

4.4.3.1.11. centrifugēt 20 min 4⁰ C temperatūrā pie 15 000 g un atdalīt etanolu no ekstrakta koncentrāta;

4.4.3.1.12. pievienot 500 mkl 80 % etanola (- 20⁰ C) un samaisīt, mēģeni apgriežot otrādi;

4.4.3.1.13. centrifugēt 10 min 4⁰ C temperatūrā pie 15 000 g, saglabāt ekstrakta koncentrātu un atdalīt etanolu;

4.4.3.1.14. ļaut ekstraktam izžūt istabas temperatūrā vai DNS vakuumžāvētājā;

4.4.3.1.15. atkārtoti suspendēt ekstrakta koncentrātu 100 mkl sterila ultratīra ūdens un atstāt istabas temperatūrā vismaz uz 20 minūtēm;

4.4.3.1.16. līdz izmantošanai PCR glabāt - 20⁰ C temperatūrā;

4.4.3.1.17. centrifugējot atdalīt baltas nogulsnes, ja tādas ir, un PCR izmantot 5 mkl virsējā slāņa, kas satur DNS;

4.4.3.2. citas DNS ekstrakcijas metodes (piemēram, Qiagen DNeasy Plant Kit) var izmantot ar nosacījumu, ka ir pierādīta to līdzvērtīga efektivitāte DNS attīrīšanā no kontrolparaugiem, kas vienu mililitru satur 10³ līdz 10⁴ patogēno baktēriju.

4.4.4. PCR:

4.4.4.1. sagatavot PCR testa un kontroles paraugus saskaņā ar validētu protokolu. Sagatavot vienu no parauga iegūta DNS ekstrakta decimālatšķaidījumu (1:10 ultratīrā ūdenī);

4.4.4.2. saskaņā ar publicēto protokolu sagatavot atbilstošu PCR reakcijas maisījumu vidē, kurā nevar notikt inficēšanās. Validētais PCR protokols ir daudzkārtēja reakcija, kas ietver arī PCR iekšējo kontroli;

4.4.4.3. pievienot 5 mkl DNS ekstrakta uz katriem 25 mkl PCR reaģenta sterilās PCR mēģenēs;

4.4.4.4. sagatavot negatīvā kontroltesta paraugu, kas satur tikai PCR reakcijas maisījumu, un parauga vietā pievienot tās pašas izcelsmes sterilu ūdeni, kas tika izmantots PCR maisījumā;

4.4.4.5. ievietot mēģenes tajā pašā termokamerā, ko izmantoja iepriekšējās pārbaudēs, un īstenot optimizēto PCR programmu saskaņā ar šo noteikumu 5.pielikumu;

4.4.5. PCR produkta analīze:

4.4.5.1. sadalīt PCR amplikonus ar agarozes gela elektroforēzi. To veic ar 5 - 8 V/cm, ņemot vismaz 12 mkl DNS pavairošanas reakcijas maisījuma no katra parauga, kas sajaukts ar 3 mkl parauga uznešanas buferšķīduma (5.pielikums) 2,0 % (m/v) agarozes gela tris-actetāt-EDTA (TAE) buferšķīdumā. Izmantot atbilstošu DNS marķieri, piemēram, "100 bp ladder";

4.4.5.2. lai izceltu DNS joslas, 30 - 45 min tās krāsot ar etīdija bromīdu (0,5 mg/l), ievērojot atbilstošus piesardzības pasākumus darbam ar šo mutagēno vielu;

4.4.5.3. PCR produktiem, kuru izmērs atbilst paredzētajam, izgaismot iekrāsoto gelu ar īsviļņu UV transiluminatoru (piemēram, X = 302 nm), un ainu dokumentēt;

4.4.5.4. visiem no jauna konstatētajiem gadījumiem salīdzināt PCR amplikona autentiskumu, veicot fermentu restrikcijas analīzi atlikušajam DNS pavairošanas paraugam, optimālā temperatūrā optimālu laiku inkubējot ar atbilstošu fermentu un buferšķīdumu. Identificēt fragmentus, kas sašķelti agarozes gela elektroforēzē pēc iepriekš norādītās metodes, un izgaismot ar UV transiluminatoru fragmentu raksturīgo izvietojumu pēc restrikcijas ar fermentu un iekrāsošanas ar etīdija bromīdu. Salīdzināt pozitīvās liecības pirms sašķelšanas un pēc tās;

4.4.6. PCR testa rezultātu interpretācija:

4.4.6.1. ja PCR testa rezultāts ir negatīvs, ja organismamraksturīgais paredzamā izmēra PCR amplikons attiecīgajā paraugā netiek konstatēts, bet to konstatē visos pozitīvajos kontroltestos daudzkārtējas PCR gadījumā ar augiem raksturīgiem iekšējās kontroles praimeriem: otrais paredzamā izmēra PCR produkts jāpavairo ar attiecīgo paraugu;

4.4.6.2. PCR testa rezultāts ir pozitīvs, ja tiek konstatēts īpašais organisma paredzamā izmēra PCR amplikons ar raksturīgo izvietojumu pēc restrikcijas (vajadzības gadījumā), ar nosacījumu, ka tas nav iegūts no kāda no negatīvo kontroltestu paraugiem. Drošu pozitīvā rezultāta apstiprinājumu var iegūt arī, atkārtojot testu ar otru PCR praimeru komplektu. Var rasties aizdomas par PCR traucējumiem, ja paredzamais amplikons ir iegūts no pozitīvā kontroltesta parauga, kas satur C. m. subsp. sepedonicus ūdenī, bet pozitīvie kontroltesti ar C. m. subsp. sepedonicus kartupeļu ekstraktā uzrāda negatīvus rezultātus. Daudzkārtējas PCR protokolos ar iekšējiem PCR kontroltestiem uz reakcijas traucējumiem norāda tas, ka neviens no abiem amplikoniem netiek iegūts. Aizdomas par inficēšanos var rasties, ja paredzamais amplikons ir iegūts no viena vai vairākiem negatīvajiem kontroltestiem.

5. Biopatogenitātes tests:

5.1. iepriekšējā orientējošā testēšana pēc šīs metodes nodrošina reproducējama noteikšanu 10³ līdz 104 organisma kolonijas veidojošo vienību vienā mililitrā, ja tās pievieno paraugu ekstraktiem, kas iepriekš uzrādījuši negatīvus rezultātus. Visaugstākā noteikšanas jutība sagaidāma, izmantojot tikko sagatavotu paraugu ekstraktu un nodrošinot optimālus attīstības apstākļus. Tomēr šo metodi var veiksmīgi izmantot arī ekstraktiem, kas glabāti - 68 līdz - 86⁰ C temperatūrā glicerīna šķīdumā. Dažas baklažānu šķirnes ir teicama selektīva barotne organisma attīstībai pat tad, ja nav simptomu, kā arī nodrošina teicamu saimniekauga apstiprinājuma testu. Lai samazinātu kļūdaini negatīvu testa rezultātu risku, attīstības apstākļiem jābūt optimāliem, saskaņā ar šo noteikumu 7.pielikumā norādītājiem audzēšanas apstākļiem.

5.2. sadalīt atkārtoti suspendētā ekstrakta koncentrāta visu atlikušo daļu baklažānu augiem, izmantojot vienu no turpmāk aprakstītajām metodēm. Izmantot tikai augus 2 - 3 lapu attīstības stadijā līdz brīdim, kad pilnīgi attīstījusies trešā īstā lapa. Lai nodrošinātu, ka atkārtoti suspendētais ekstrakta koncentrāts tiek izmantots pilnīgi un turpmāk minētie inokulācijas procesi būtu efektīvi, turpmāk aprakstīto procedūru izpildei nepieciešami paraugi, ko veido 15 - 25 baklažānu augi;

5.3. baklažānu augus nelaistīt divas dienas pirms inokulācijas sākuma, lai samazinātu turgora spiedienu;

5.4. inokulācija ar šķēlumu:

5.4.1. pieturot augu ar diviem pirkstiem, uz stublāja, starp dīgļlapām un pirmo lapu ar pipeti ievadīt vienu pilienu suspendēta ekstrakta koncentrātu (apmēram 5 līdz 10 mkl);

5.4.2. ar sterilu skalpeli izdarīt aptuveni 1,0 cm garu un apmēram 2/3 no stublāja diametra dziļu diagonālu griezumu, griezienu sākot no punkta, kurā ievadīts ekstrakta koncentrāta piliens;

5.4.3. griezumu cieši noslēgt ar sterilu vazelīnu no šļirces;

5.5. inokulācija ar šļirci:

5.5.1. baklažānu stublājus inokulēt uzreiz virs dīgļlapām, izmantojot šļirci ar adatu zemādas injekcijām (ne mazāku par 23G). Sadalīt ekstrakta koncentrātu starp baklažānu augiem;

5.5.2. pozitīviem kontroltestiem inokulēt piecus augus ar ūdens suspensiju, kuras vienu mililitru satur 10⁵ līdz 10⁶ zināmas organisma kultūras šūnas, un, ja iespējams, ar dabīgi inficētu bumbuļu audiem, izmantojot to pašu inokulācijas metodi;

5.5.3. negatīviem kontroltestiem piecus augus inokulē ar sterilu ekstrakta koncentrāta šķīdumu, izmantojot to pašu inokulācijas metodi;

5.5.4. karantīnas apstākļos augus 18 - 24⁰ C temperatūrā inkubēt četras nedēļas. Augus inkubē pietiekamā apgaismojumā, piemērotā mitrumā (70 - 80 %) un laista, lai novērstu ūdens izsīkšanu vai auga novīšanu ūdens trūkuma dēļ. Organisma šūnas iet bojā temperatūrā, kas pārsniedz 30⁰ C, bet optimālā attīstības temperatūra ir 21⁰ C. Lai nepieļautu inficēšanos, pozitīvo kontroltestu un negatīvo kontroltestu paraugus inkubēt uz atsevišķiem siltumnīcas plauktiem vai audzēšanas kamerās, vai, ja nepietiek vietas, stingri nodalīt apstrādes materiālus. Ja augus dažādiem paraugiem inkubē cieši blakus, tos atdala ar atbilstošiem aizslietņiem. Mēslojot, laistot, pārbaudot un veicot citas darbības, ir piesardzīgs, lai neizraisītu savstarpēju inficēšanos. Ir ļoti svarīgi, lai siltumnīcās nebūtu kaitēkļu, jo tie var pārnest baktērijas no viena auga uz citu.

5.5.5. pēc nedēļas sākt simptomu regulāru pārbaudi. Saskaita, cik augiem ir raksturīgie simptomi. Organismi izraisa baklažānu lapu vīšanu, kas var sākties kā ļenganums lapu malās vai starp lapas dzīslām. Savītušiem audiem sākotnēji var būt tumši zaļa krāsa vai plankumi, bet pirms atmiršanas tie kļūst bālāki. Savītuši audi starp lapas dzīslām bieži izskatās kā taukaini un it kā piepildīti ar ūdeni. Atmirušiem audiem bieži ir spoži dzeltena robežlīnija. Augi var pilnībā neaiziet bojā, jo ilgāks ir periods, kad neparādās slimības pazīmes, jo lielāka ir augu izdzīvošanas iespēja. Augi var izturēt infekciju. Pret mik­roorganismiem ieņēmīgi jauni baklažānu augi ir daudz jutīgāki pret mazām organisma populācijām nekā vecāki augi, tādēļ ir nepieciešams izmantot augus 3.lapas stadijā vai tikko pirms tās. Vīšanu var izraisīt arī citu baktēriju vai sēnīšu populācijas, kas var būt bumbuļu audu ekstrakta koncentrātā. Tās var būt Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora, subsp. carotovora un E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chry-santhemi, Phoma exigua var. foveata, kā arī plašas saprofīto baktēriju populācijas. Jo īpaši Erwinia chrysanthemi var izraisīt lapu simptomus un vīti, kas ir ļoti līdzīga C. m. sepedonicus simptomiem. Vienīgā atšķirība ir stumbra melnēšana Erwinia chrysanthemi infekcijas gadījumā. Cita veida vīšanu var atšķirt no organisma izraisītās vīšanas, tā kā veselas lapas vai pat veseli augi vīst ļoti ātri. Var sagatavot arī krāsojumu pēc Grama - šis tests atšķirs organismu no Erwinia spp.;

5.5.6. tiklīdz baklažānu augiem ir vērojami simptomi, veic atkārtotu izolāciju, izmantojot šo augu savītušos lapu audus un stublāja audus. Dezinficēt baklažānu lapu virsmas un stublājus, notīrot tos ar 70 % etanolu. Veikt baklažānu sulas IF testu vai PCR un izolēt atbilstošā (selektīvā) barotnē. Var sagatavot arī krāsojumu pēc Grama. Identificēt iespējamās organisma tīrkultūras un apstiprināt patogenitāti;

5.5.7. noteiktos apstākļos, jo īpaši tad, ja audzēšanas apstākļi nav optimāli, organisma var saglabāties baklažānu augos kā latenta infekcija pat pēc četru nedēļu inkubācijas. Ja simptomi netiek novēroti pēc četrām nedēļām, veic IF vai PCR tests apvienotam paraugam, kas sastāv no viena centimetra gariem stublāja posmiem, kuri no katra testa auga ņemti virs inokulācijas vietas. Ja testa rezultāts ir pozitīvs, veic atkārtotu izolāciju piemērotā (selektīvā) barotnē. Identificēt iespējamās organisma tīrkultūras un apstiprināt patogenitāti kā minēts iepriekš;

5.6. biopatogenitātes testa rezultātu interpretēšana:

5.6.1. derīgus biopatogenitātes testa rezultātus iegūst, ja pozitīvā kontroltesta augiem konstatē tipiskus simptomus, no šiem augiem baktērijas var izolēt atkārtoti, un negatīvajos kontroltestos simptomus nekonstatē.

5.6.2. biopatogenitātes testa rezultāti ir negatīvi, ja testa augi nav inficēti ar organismu, ar nosacījumu, ka organisms tiek konstatēta pozitīvajos kontroltestos;

5.6.3. biopatogenitātes testa rezultāts ir pozitīvs, ja augi ir inficēti ar organismu.

6. Organisma izolēšana:

6.1. diagnozi var apstiprināt tad, ja organisms ir izolēts, pēc tam identificēts un apstiprināts ar patogenitātes testu. Kaut gan organisms ir izvēlīgs organisms, to var izdalīt no audiem ar inficēšanās pazīmēm. Tomēr to var nomākt saprofītās baktērijas, kas ātri attīstās, un tāpēc tieša izdalīšana no bumbuļu vai stublāju audu ekstrakta koncentrāta ir sarežģīta. Ar selektīvu barotni un atbilstošu atkārtoti suspendētu kartupeļu stolona pamatņu vai stublāju ekstrakta koncentrāta šķīdumu ir iespējama tieša organisma izolēšana. Izolēšanu veic visiem kartupeļu bumbuļiem vai stublāju segmentiem un baklažāniem, kuriem nav inficēšanās pazīmju, bet attiecībā uz kuriem rezultāts IF vai PCR testam, izmantojot apvienoto paraugu, bija pozitīvs. Pozitīviem kontroltestiem izmanto tādas suspensijas decimālatšķaidījumus, kurā ir 10⁶ kolonijas veidojošo vienību organisma mililitrā (piemēram, NCPPB 4053 vai PD 406). Lai izvairītos no iespējamās inficēša­nās, pozitīvos kontroltestus pilnībā nodala no paraugiem, kurus paredzēts testēt. Katrai tikko sagatavotai selektīvās barotnes partijai pirms paredzētās paraugu testēšanas pārbauda tās atbilstību patogēna attīstībai. Testēt kontroles materiālu tāpat kā paraugu;

6.2. selektīvie uzsējumi:

6.2.1. izmantojot 100 mkl atkārtoti suspendēta kartupeļu ekstrakta koncentrāta vai baklažānu sulas atlikumu, pagatavot desmitkārtīgu atšķaidījumu ekstrakta koncentrāta buferšķīdumā (3.pielikums);

6.2.2. izolēšana no neatšķaidīta kartupeļu ekstrakta koncentrāta parasti neizdodas, jo Cms ir ļoti jutīga attiecībā uz augšanas veidu un konkurenci ar saprofītiem. Tā kā baktērijas inficētajos audos parasti tiek konstatētas lielās populācijās, saprofītus var izšķīdināt saglabājot patogēnus. Tāpēc ir ieteicams no katra parauga 100 mkl 1/100 līdz 1/10 000 atšķaidījuma pārnest uz MTNA barotnes vai NCP-88 barotnes (izmantojot Petri traukus ar diametru 90 mm, citiem trauku izmēriem attiecīgi pielāgo daudzumu), izmantojot stienīti (stikla stienīti) un ar metodi, kas paredz parauga izlīdzināšanu uz plates. Alternatīva iespēja ir 100 mkl sākotnējā kartupeļu ekstrakta koncentrāta izlīdzināt uz pirmās agara plates ar stienīti, un tad uz stienīša esošo atlikumu noslaucīt gar otro agara plati; visbeidzot to pašu atkārtot gar trešo plati, tādējādi ar stienīti uzsējot atšķaidījumu;

6.2.3. izturēt plates tumsā 21 - 23⁰ C temperatūrā;

6.2.4. sākotnējā plašu pārbaudē, to­starp salīdzinot ar kontroltestu platēm, pēc trīs dienām saskaita organismam līdzīgās kolonijas, turpmāko skaitīšanu veicot pēc piecām, septiņām un beidzot pēc 10 dienām;

6.3. aizdomīgo koloniju attīrīšana:

6.3.1. uz YGM barotnes veic organismam līdzīgo koloniju uzsējums nolūkā turpmāk veikt baklažānu augu inokulāciju vai identifikāciju; tas jāveic, pirms plates ir pāraugušas, pēc 3 - 5 dienām;

6.3.2. uzsēt organismam līdzīgās kolonijas uz vienas no šādām barotnēm:

6.3.2.1. barojošs dekstrozes agars (izmantojams tikai pārsēšanai);

6.3.2.2. rauga peptona glikozes agars;

6.3.2.3. barojošs rauga ekstrakta minerālsāļu agars;

6.3.2.4. inkubēt 21 - 24⁰ C temperatūrā līdz 10 dienām. Organisms ir lēni augošs organisms, kas parasti 10 dienās veido niecīgi mazas (kā adatas smaile) krēmkrāsas kupolveidīgas kolonijas;

6.4. pārsēšana tīrkultūru iegūšanai. Augšanas ātrums palielinās pēc pārsēšanas. Tipiskas kolonijas ir krēmbaltā vai ziloņkaula krāsā, dažkārt dzeltenas, noapa­ļotas, gludas, paaugstinātas, ar izliektu kupolveidīgu formu, gļotaini šķidras, ar veselām malām un parasti no viena līdz 3 mm diametrā. Parastā krāsošana pēc Grama var palīdzēt izvēlēties kolonijas turpmākām pārbaudēm;

6.5. identificēt iespējamās kultūras un veikt patogenitātes testu.

7. identifikācija:

7.1. identificē iespējamās organisma izolātu tīrkultūras, izmantojot vismaz divus no minētajiem testiem, kas balstīti uz dažādiem bioloģiskajiem principiem. Attiecīgā gadījumā iekļaut zināmus references celmus katram veiktajam testam;

7.2. audzēšanas barotnēs un fermentatīvās identifikācijas testi:

7.2.1. noteikt turpmāk norādītās fenotipiskās pazīmes, kas pastāvīgi ir vai nav konstatējamas organisma saskaņā ar metodēm Lelliot un Stead (1987), Klement et.al. (1990), Schaad (2001), anonīms aut. (1987);

7.2.2. visas barotnes inkubē 21⁰ C temperatūrā un apskata pēc sešām dienām. Ja augšana nenotiek, tās inkubē līdz 20 dienām.

7.2.3. visos testos iekļauj organisma kontroltestu. Barības vielu un fermentu identifikācijas testi jāveic attiecībā uz inokulātu no pārtikas agara uzsējuma. Morfoloģiskos salīdzinājumus veic, izmantojot kultūras, kas audzētas uz barojoša dekstrozes agara:

Testi	Sagaidāmais rezultāts
Oksidācijas/ fermentācijas (O/F) tests	Inerta vai vāji oksidatīva
Oksidāzes aktivitāte
Pieaugums 370 C temperatūrā
Ureāzes izstrāde
Eskulīna hidrolīze	+
Cietes hidrolīze	- vai vāji izteikta
Tolerance pret 7 % NaCl
Indola tests
Katalāzes aktivitāte	+
H2S izstrāde	-
Citrāta patēriņš
Želatīna sašķidrināšana	-
Skābe no glicerīna
Skābe no laktozes	- vai vāji izteikta
Skābe no ramnozes
Skābe no salicīna
Krāsojums pēc Grama	+

7.3. IF tests:

7.3.1. sagatavot suspensiju IF buferšķīdumā, kurā ir aptuveni 10⁶ šūnas mililitrā;

7.3.2. sagatavot atbilstošās antivielas divkāršu atšķaidījumu sērijas;

7.3.3. veikt IF procedūru;

7.3.4. IF testa rezultāts ir pozitīvs, ja kultūras IF titrs ir vienāds ar pozitīvā kontroltesta titru;

7.4. PCR tests:

7.4.1. sagatavot suspensiju ultratīrā ūdenī, kurā ir aptuveni 10⁶ šūnas ml;

7.4.2. 100 ul šūnu suspensijas slēgtās mēģenēs termokamerā vai verdoša ūdens vannā četras minūtes karsē 100⁰ C temperatūrā. Nepieciešamības gadījumā tikko sagatavota NaOH pievienošana 0,05 M galīgajai koncentrācijai var palīdzēt šūnu lizēšanai. Tad paraugus var glabāt - 16 līdz - 24⁰ C temperatūrā, līdz tie ir nepieciešami;

7.4.3. veikt atbilstošās PCR procedūras, lai pavairotu organismam raksturīgos amplikonus;

7.4.4. organisma identifikācija ir pozitīva, ja PCR amplikoniem ir tādi paši restrikcijas fragmentu garuma polimorfismi un amplikoni ir vienādi pēc izmēra ar pozitīvā kontroltesta celmu;

7.5. FISH tests:

7.5.1. sagatavot suspensiju ultratīrā ūdenī, kurā ir aptuveni 10⁶ šūnas ml;

7.5.2. veikt FISH procedūru;

7.5.3. FISH testa rezultāts ir pozitīvs, ja uzsējuma un pozitīvā kontroltesta reakcijas ir vienādas.

7.6. taukskābju sastāva profilēšanas tests (FAP):

7.6.1. audzēt kultūru uz triptāzes sojas agara (Oxoid) 72 stundas 21⁰ C temperatūrā (± 1⁰ C);

7.6.2. izmantot atbilstošu FAP procedūru (Janse, 1991; Stead, 1992);

7.6.3. FAP testa rezultāts ir pozitīvs, ja iespējamās kultūras profils ir vienāds ar pozitīvā kontroltesta profilu. Taukskābes 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 un 17:0 Anteiso ir raksturīgas C. m. sepedonicus. Citām ģintīm piederīgām baktērijām, piemēram, Curtobacterium, Arthrobacter un Micrococcus, arī ir dažas no šīm taukskābēm, bet 15:1 Anteiso A ir reta skābe šajās baktērijās; tā ir visās Clavibacter spp. robežās no 1 % līdz 5 %. C. m. sepedonicus baktērijās šis daudzums parasti ir aptuveni 5 %;

7.7. BOX-PCR:

7.7.1. sagatavot suspensiju ultratīrā ūdenī, kurā ir aptuveni 10⁶ šūnas ml;

7.7.2. veikt testu saskaņā ar procedūru (Smith et al., 2001).

8. Apstiprinājuma tests:

8.1. patogenitātes testu veic, lai galīgi apstiprinātu organisma diagnozi un apstiprinātu kultūru virulenci, kas identificētas kā organisms;

8.2. no testējamā izolāta triju dienu uzsējuma sagatavot inokulātu, kurā ir aptuveni 10⁶ šūnas ml, un sagatavot pozitīvā kontroltesta organisma celmu;

8.3. inokulēt 5 - 10 jaunu baklažānu sēklaudžu stublājus triju lapu fāzē;

8.4. inkubēt 18 - 24⁰ C temperatūrā pietiekamā apgaismojumā, augstā relatīvajā mitrumā un laistīt, lai novērstu ūdens izsīkšanu vai auga novīšanu ūdens trūkuma dēļ. Tīrkultūrām raksturīgo vīti novēro 2 nedēļu laikā, taču augus, kuriem nav inficēšanās pazīmju pēc minētā laika, turpina audzēt līdz 3 nedēļu perioda sasniegšanai tādā temperatūrā, kas veicina baklažānu augu attīstību, bet nav augstāka par 25⁰ C. Ja pēc 3 nedēļām nav inficēšanās pazīmju, kultūru nevar apstiprināt kā organisma patogēno formu;

8.5. augiem ar inficēšanās pazīmēm izolēt stumbra daļu, ko izgriež 2 cm virs inokulācijas vietas. Sasmalcināt un suspendēt nelielā daudzumā sterila destilēta ūdens vai 50 mM fosfāta buferšķīduma. Izo­lēt no suspensijas uzklājot vai uzsējot atšķaidījumu uz MTNA vai YPGA, 3 - 5 dienas inkubēt 21 - 23⁰ C temperatūrā un novērot organisma tipisko koloniju veidošanos.

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
2.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.365

Barotnes organisma izolācijai un audzēšanai

1. Vispārējas augšanas barotnes

Barojošs agars (NA)

Barojošs agars (Difco) 23,0 g

Destilēts ūdens 1,0 l

1.1. izšķīdināt sastāvdaļas un 15 minūtes sterilizēt autoklāvā 121⁰ C temperatūrā;

1.2. barojošs dekstrozes agars (NDA);

1.3. barojošs agars (Difco bacto), kas satur 1 % D(+) glikozes (monohidrāta). Sterilizēt 20 min autoklāvā 115⁰ C temperatūrā;

1.4. rauga peptona glikozes agars (YPGA):

Rauga ekstrakts (Difco)	5,0 g
Baktopeptons (Difco)	5,0 g
D(+)-glikoze (monohidrāts)	10,0 g
Baktoagars (Difco)	15,0 g
Destilēts ūdens	1,0 l

1.5. izšķīdināt sastāvdaļas un 15 min sterilizēt autoklāvā 121⁰ C temperatūrā.

1.6. rauga ekstrakta minerālsāļu barotne (YGM);

Bakto rauga ekstrakts (Difco) 2,0 g

D(+) Glikoze (monohidrāts) 2,5 g

K2HPO4	0,25 g
KH2PO4	0,25 g
MgSO4.7H2O	0,1 g
MnSO4. H2O	0,015
NaCl	0,05 g
FeSO4.7H2O	0,005
Baktoagars (Difco)	18 g
Destilēts ūdens	1,0 l

1.7. Izšķīdināt sastāvdaļas un devās pa 0,5 l sterilizēt 20 min autoklāvā 115⁰ C temperatūrā.

2. Validētās selektīvās augšanas barotnes

MTNA barotne

Ja nav norādīts citādi, visi barotnes komponenti ir no BDH:

Rauga ekstrakts (Difco) 2,0 g

Mannīts 2,5 g

K₂HPO₄ 0,25 g

H2PO4	0,25 g
NaCl	0,05 g
MgSO4.7H2O	0,1 g
MnSO4. H2O0	0,015
FeSO4.7H2O	0,005
Agars (Oxoid Nr.1)	16,0 g
Destilēts ūdens	1,0 l

2.1. izšķīdināt sastāvdaļas, līdzsvarot pH līdz 7,2. Pēc sterilizēšanas autoklāvā (15 min 121⁰ C temperatūrā) un atdzišanas līdz 50⁰ C pievienot antibiotikas: trimetroprimu 0,06 g, nalidiksīnskābi 0,002 g, amfotericīnu B 0,01 g;

2.2. antibiotiku standartšķīdumi: trimetroprims (Sigma) un nalidiksīnskābe (Sigma) (abi 5 mg/ml), 96 % metanolā, amfo-tericīns B (Sigma) (1 mg/ml) dimetilsulfoksīdā. Standartšķīdumus sterilizē filtrējot;

Piezīme:

Pamatbarotnes derīguma termiņš ir 3 mēneši. Pēc antibiotiku pievienošanas derīguma termiņš ir 1 mēnesis, ja to uzglabā atdzesētu.

NCP-88 barotne

Barojošs agars (Difco)	23 g
Rauga ekstrakts (Difco)	2 g
D-mannīts	5 g
K2HPO4	2 g
KH2PO4	0,5 g
MgSO4.7H2O	0,25 g
Destilēts ūdens	1,0 l

2.3. izšķīdināt sastāvdaļas, noregulēt pH līdz 7,2. Pēc sterilizēšanas autoklāvā un atdzesēšanas līdz 50⁰ C pievienot šādas antibiotikas: polimiksīna B sulfātu (Sigma) 0,003 g, nalidiksīnskābi (Sigma) 0,008 g, cikloheksimīdu (Sigma) 0,2 g;

2.4. izšķīdināt antibiotikas standartšķīdumos šādā veidā: nalidiksīnskābi 0,01 M NaOH, cikloheksimīdu 50 % etanolā, polimiksīna B sulfātu destilētā ūdenī. Rezerves šķīdumus sterilizē filtrējot.

Piezīme:

Pamatbarotnes derīguma termiņš ir trīs mēneši. Pēc antibiotiku pievienošanas derīguma termiņš ir viena mēnesis, ja to uzglabā atdzesētu.

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
3.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.365

Buferšķīdumi testu procedūrām

1. Sterilus buferšķīdumus neatvērtā veidā var glabāt ne ilgāk kā vienu gadu;

1.1. Ekstrakcijas procedūras buferšķīdumi. Ekstrakcijas buferšķīdumi (50 mM fosfāta buferšķīdums, pH 7,0). Šo buferšķīdumu izmanto baktēriju ekstrakcijai no augu audiem ar homogenizācijas vai kratīšanas metodi:

Na₂HPO₄ (bez ūdens) 4,26 g

KH₂PO₄ 2,72 g

Destilēts ūdens 1,00 l

1.2. izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un 15 min sterilizēt autoklāvā 121⁰ C temperatūrā. Papildu komponentus var lietot šādi:

	Mērķis	Daudzums (uz l)
Lubrola pārslas	Deflokulants (*)	0,5 g
DC silikona pretputu līdzeklis	Pretputošanas līdzeklis (*)	1,0 ml
Tetranātrija pirofosfāts	Antioksidants	1,0 g
Polivinilpirolidons-40 000 (PVP-40)	PCR inhibitoru saistīšnai	50 g

(*) Izmantošanai ar homogenizācijas ekstrakcijas metodi.

1.3. Nogulšņu buferšķīdumi (10 mM fosfāta buferšķīdums, pH 7,2).

Šo buferšķīdumu izmanto, lai atkārtoti suspendētu un atšķaidītu ekstraktu no kartupeļu bumbuļu stolona pamatnes gabaliem, kas koncentrēts ar centrifugēšanas metodi.

Na₂HPO₄.12H₂O 2,7 g

NaH₂PO₄.2H₂O 0,4 g

Destilēts ūdens 1,00 l

Izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un 15 min sterilizēt autoklāvā 121⁰ C temperatūrā.

2. IF testa buferšķīdumi:

2.1. IF buferšķīdums (10 mM fosfātbuferēts nātrija hlorīda fizioloģiskais šķīdums, (PBS) pH 7,2). Šo buferšķīdumu izmanto antivielu atšķaidīšanai:

Na₂HPO₄.12H₂O 2,7 g

NaH₂PO₄.2H₂O 0,4 g

NaCl 8,0 g

Destilēts ūdens 1,0 l

Izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un 15 min sterilizēt autoklāvā 121⁰ C temperatūrā.

2.2. IF-Tween buferšķīdums. Šo buferšķīdumu izmanto priekšmetstikliņu mazgāšanai. Pievienot IF buferšķīdumam 0,1 % Tween 20.

2.3. Fosfātbuferēts glicerīns, pH 7,6. Šo buferšķīdumu izmanto kā histoloģisko šķidrumu, ko uznes IF priekšmetstikliņa lodziņiem, lai pastiprinātu fluorescenci.

Na2HPO4.12H2O	3,2 g
NaH2PO4.2H2O	0,15 g
Glicerīns	50 ml
Destilēts ūdens	100 ml

Pret izbalēšanu noturīgi histoloģiskie šķidrumi ir nopērkami gatavi, piemēram, Vectashield® (Vector Laboratories) vai Citifluor® (Leica).

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
4.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.365

Inficēšanās līmeņa noteikšana ar IF un FISH testu

1. Saskaitīt raksturīgi fluorescējošo šūnu vidējo skaitu vienā laukā (c).

2. Aprēķināt raksturīgi fluorescējošo šūnu skaitu vienā mikroskopa lodziņā (C).

C = c x S/s, kur

S = daudzlodziņu priekšmetstikliņa viena lodziņa virsmas laukums un

s = objektīva redzes lauka virsmas platība.

s = Tri²/4G²/K²/, kur

i = lauka koeficients (atkarībā no okulāra tipa tas var būt robežās no 8 - 24),

K = mēģenes koeficients (1 vai 1,25),

G = objektīva palielinājums (100 x, 40 x u.c.).

3. Aprēķināt raksturīgo fluorescējošo šūnu skaitu vienā mililitrā atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta (N).

N = C x 1 000/y ^{x F}, kur

y = atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta daudzums katrā lodziņā un

F = atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta atšķaidījuma pakāpe.

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
5.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.365

Validēts PCR protokols un reaģenti

1. Lai iepriekšējo testu reproducējamā noteikšanas jutība būtu vismaz 10³ līdz 10⁴ C. m. sepedonicus šūnas mililitrā parauga ekstrakta. Tāpat arī iepriekšējie testi nedrīkst uzrādīt nevienu šķietami pozitīvu rezultātu attiecībā uz izvēlēto baktēriju celmiem

2. Mmkltiplās PCR protokols ar iekšējo PCR kontroli (Pastrik, 2000)

2.1. Oligonukleotīdi

Augšupejošais oligonukleotīds PSA-1 5'- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3'

Lejupejošais oligonukleotīds PSA-R 5'- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3'

Augšupejošais oligonukleotīds PNS-7-F 5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3'

Lejupejošais oligonukleotīds PNS-8-R 5'- tcc gca ggt tca cct acg ga -3'

Paredzamais amplikona izmērs no C. m. subsp. sepedonicus DNS matricas - 502 bp (PSA-Oligonukleotīdu pāris).

Paredzamais amplikona izmērs no 18S rRNA iekšējās PCR kontroles - 377 bp (NS Oligonukleotīdu pāris).

2.2. PCR reakcijas maisījums

Reaģents	Reaģenta daudzums	Galīgā koncentrācija
Sterils ultratīrs ūdens	15,725 mkl
10 x PCR buferšķīdums 0) (15 mM MgCl2)	2,5 mkl	11 x (1,5 mM MgCl2)
BSA (V frakcija) (10 %)	0,25 mkl	0,1 %
dNTP maisījums (20 mM)	0,125 mkl	0,1 mM
Oligonukleotīds PSA-1 (10 mkM)	0,5 mkl	0,2 mkM
Oligonukleotīds PSA-R (10 mkM)	0,5 mkl	0,2 mkM
Oligonukleotīds NS-7-F (10 mkM) (2)	0,1 mkl	0,04 mkM
Oligonukleotīds NS-8-R (10 mkM) (2)	0,1 mkl	0,04 mkM
Taq polimerāze (5 U/mkl) (1)	0,2 mkl	1,0 U
Parauga tilpums	5,0 mkl
Kopējais tilpums:	25,0 mkl

(¹) Metodes validētas, izmantojot Taq polimerāzi no Perkin Elmer (AmpliTaq vai Gold) un Gibco BRL.

(²) NS-7 F un NS-8-R ologonukleotīdu koncentrācija tika optimizēta kartupeļu stolona gabalu ekstrakcijai, izmantojot homogenizācijas metodi un DNS attīrīšanu pēc Pastrik (2000) metodes. Reaģentu koncentrācijas atkārtota optimizācija ir nepieciešama, ja izmanto ekstrakciju ar kratīšanas metodi vai citu DNS izolācijas metodi.

2.3. PCR reakcijas apstākļi

Veikt šādu programmu:

1 cikls	3 minūtes 950 C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana)
10 cikli	1 minūti 950 C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana)
	1 minūti 640 C temperatūrā (oligonukleotīdu hibridizācija)
	1 minūti 720 C temperatūrā (kopijas sintēze)
25 cikli	30 sekundes 950 C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana)
	30 sekundes 620 C temperatūrā (oligonukleotīdu kušana)
	1 minūti 720 C temperatūrā (kopijas sintēze)
1 cikls	5 minūtes 720 C temperatūrā (fragmentu galu aizpildīšana)
	uzglabāt 40 C temperatūrā

Piezīme:

Šī programma ir optimizēta izmantošanai ar MJ Research PTC 200 ciklisko termostatu.

2.4. Amplikona restriktāzes analīze

No C. m. subsp. sepedonicus DNS pavairotie PCR produkti veido atšķirīgu restrikcijas fragmentu garuma polimor-fismu ar fermentu Bgl II pēc 30 min ilgas inkubācijas 37⁰ C temperatūrā. No C. m. subsp. sepedonicus iegūto restrikcijas fragmentu raksturīgais izmērs ir 282 bp un 220 bp.

3. Parauga uznešanas buferšķīduma pagatavošana:

3.1. Bromfenolzilais (10 % rezerves šķīdums)

Bromfenolzilais 5 g

Bidestilēts ūdens 50 ml

3.2. Parauga uznešanas buferšķīdums

Glicerīns (86 %) 3,5 ml

Bromfenolzilais (5.1.) 300 mkl

Bidestilēts ūdens 6,2 ml

4. 10 x tris-acetāt-EDTA (TAE) buferšķīdums, pH 8,0

Tris buferšķīdmkMs 48,4 g

Ledus etiķskābe 11,42 ml

EDTA (dinātrija sāls) 3,72 g

Destilēts ūdens 1,00 l

Pirms lietošanas atšķaidīt 1 x.

Pieejams arī tirdzniecībā (piemēram, Invitrogen vai līdzvērtīgs).

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
6.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.365

Validētie FISH testa reaģenti

1. Oligozondes:

1.1. Cms raksturīgā zonde CMS-CY3-01: 5'- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3';

Nespecifisko eubaktēriju zonde EUR-338-FITC: 5'- gct gcc tcc cgt agg agt-3';

2. Fiksējošais šķīdums:

2.1. fiksējošais šķidums satur paraformaldehīdu, kas ir toksisks;

2.2. līdz aptuveni 60⁰ C uzsildīt 9 ml ultratīra ūdens (piemēram, ultratīru ūdeni (UPW)) un pievienot 0,4 g paraformaldehīda. Paraformaldehīdu izšķīdina, pievienojot 5 pilienus 1N NaOH un maisot ar magnētisko maisītāju;

2.3. noregulēt pH līdz 7,0, pievienojot 0,1 M fosfāta buferšķīduma (PB, pH 7,0) un 5 pilienus 1N HCl. Pārbaudīt pH ar indikatorpapīru, ja nepieciešams koriģē, izmantojot HCl vai NaOH;

2.3. filtrēt šķīdumu caur 0,22 um membrānfiltru un sargāt no putekļiem, turēt 4⁰ C temperatūrā līdz turpmākai izmantošanai. Alternatīvs fiksējošais šķīdums: 96 % etanols;

3. hibridizācijas maisījums (3 x):

NaCl 2,7 M

Tris-HCl 60 mM (pH 7,4)

EDTA (sterilizēts ar
filtrēšanu un autoklavēts) 15 mM

Ja nepieciešams, atšķaidīt 1 x.

4. Hibridizācijas šķīdums:

1 x hibridizācijas šķīdums

Nātrija dodecilsulfāts (SDS) 0,01 %

Zonde EUB 338 5 ng/mkl

Zonde CMSCY301 5 ng/mkl

Sagatavot hibridizācijas šķīduma daudzumus saskaņā ar 1.tabulu. Katram priekšmetstikliņam (kas satur 2 dažādus paraugus un to dublikātus) nepieciešami 90 mkl hibridizācijas šķīduma.

1.tabula

 

Ieteicamie daudzumi hibridizācijas maisījuma pagatavošanai

		2 priekšmetstikliņi	8 priekšmetstikliņi
Sterils ultratīrs ūdens		50,1	200,4
3 x hibridizācijas maisījums		30,0	120,0
1 % SDS		0,9	3,6
Zonde EUB 338 (100 ng/ul)		4,5	18,0
Zonde CMSCY301 (100 ng/ul)		4,5	18,0
	Kopējais tilpums (ul)	90,0	360,0

Šķīdumi, kas satur gaismjutīgas oligozondes, jāglabā tumsā - 20⁰ C temperatūrā. Sargāt no tiešiem saules stariem vai elektriskā apgaismojuma to izmantošanas laikā.

5. 0,1 M fosfāta buferšķīdums, pH 7,0

Na2HPO4	8,52 g
KH2PO4	5,44 g
Destilēts ūdens	1,00 l

Izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un 15 minūtes sterilizēt autoklāvā 121 ⁰C temperatūrā.

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
7.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.365

Baklažānu kultūra

1. Iesēt baklažānu (Solanum melongena) sēklas pasterizētā sēklaudzēšanas kompostā. Pārstādīt stādus ar pilnībā izplaukušām dīgļlapām (10 līdz 14 dienas) pasterizētā kompostā;

2. Baklažāna augus audzē siltumnīcā ar šādiem vides apstākļiem:

Dienas ilgums		14 stundas vai dabīgs dienas garums, ja ilgāks
Temperatūra	dienā	21 līdz 240 C
	naktī	150 C
Piemērotās baklažānu	augu šķirnes:	Black Beauty
		Long Tom
		Rima
		Balsas

Zemkopības ministrs M.Roze

Zemkopības ministrijas iesniegtajā redakcijā
8.pielikums
Ministru kabineta
2007.gada 29.maija noteikumiem Nr.365

Pozitīvo un negatīvo kontroltestu sagatavošana svarīgākajiem skrīninga testiem PCR vai IF vai FISH

1. Sagatavot organisma virulentā celma 72 stundu uzsējumu [NCPPB 4053 vai PD 406] uz MTNA barotnes un suspendēt 10 mM fosfātšķīdumā, lai iegūtu šūnu koncentrāciju aptuveni 1 līdz 2 x 10⁸ kolonijas veidojošo vienību 1 ml. Tā parasti ir viegli duļķaina suspensija ar optisko blīvumu 0,20 pie 600 nm.

2. Atdalīt stolona pamatnes vadaudu gabalus 200 kartupeļu bumbuļiem no šķirnes ar baltu mizu, par kuriem zināms, ka tie ir brīvi no organisma.

3. Apstrādāt stolona pamatnes kā parasti un atkārtoti suspendēt ekstrakta koncentrātu 10 ml.

4. Sagatavot 10 sterilas 1,5 ml tilpuma mikromēģenes ar 900 ul atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta.

5. Pārnest 100 ul organisma suspensijas pirmajā mikromēģenē. Homogenizēt, izmantojot vorteksu. Sagatavot decimālatšķaidījumus nākamajās piecās mikromēģenēs. Sešas inficētās mikromēģenes tiks izmantotas kā pozitīvie kontrolparaugi. Četras neinficētās mikromēģenes tiks izmantotas kā negatīvie kontrolparaugi. Mikromēģenes attiecīgi marķēt.

6. Sagatavot 100 mkl testējanā parauga daļas 1,5 ml tilpuma mikromēģenēs, tādējādi iegūstot 9 katra kontrolparauga dublikātus. Līdz izmantošanai glabāt - 16 līdz - 24⁰ C temperatūrā.

7. Organisma klātbūtne un daudzums kontrolparaugos vispirms jāapstiprina ar IF testu.

8. PCR testam veikt DNS ekstrakciju no pozitīvajiem un negatīvajiem kontrolparaugiem katrā testa paraugu sērijā.

9. IF un FISH testam veikt pozitīvo un negatīvo kontrolparaugu testēšanu katrā testa paraugu sērijā.

10. IF, FISH un PCR testiem minimālajai organisma noteikšanas jutībai pozitīvajā kontrolē ir jābūt 10⁶ un 10⁴ šūnas/ml, un tās netiek atrastas nevienā negatīvajā kontrolparaugā.

Zemkopības ministrs M.Roze